手足口病ev71与ca16二联诊断金标试纸的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的制备方法，包括如下步骤：用去离子水将氯金酸稀释至0.01％，加热至95℃，稳定23min，快速加入1％的柠檬酸三钠1mL，反应至颜色呈酒红色，稳定3min后取出，继续搅拌至室温；在pH为8.0的条件下，按比例抗体量缓慢加入胶体金溶液中，室温反应30min，加入10％BSA封闭，离心，弃上清液，沉淀物用1mL TBS混匀，离心，弃上清液，重悬；在硝酸纤维素膜上进行检测线胶体金标记抗体、质控线抗体的喷涂，完成二联夹心试纸的组装。本发明提供了方便、高效的检测手段，弥补了市场上检测手足口病单一病原体的缺陷，降低临床检测费用。
【专利说明】
手足口病EV71与CA16 二联诊断金标试纸的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及医疗领域，具体涉及一种手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的制备方法。
【背景技术】
[0002]HFMD(Hand-foot-mouth disease，HFMD)为全球性传染病，分布广泛，
[0003]无明显的地域分布。早期发现的手足口病的病原体主要为CA16型，20世纪70年代初，报道了手足口病与EV71感染有关，此后EV71感染与CA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。近年来，EV71与CA16在东南亚一带流行，引起较多的重症和死亡病例。自2008年以来，我国儿童中手足口病流行趋势越来越严重。仅2010年，国家卫生部统计数据显示:中国大陆共发生I，774，669例手足口病病例，造成905例死亡和超过2万例重症。但目前尚无针对手足口病的预防性疫苗或治疗性药物，给儿童的生命健康带来了极大的威胁。
[0004]手足口病流行发生于每年的夏、秋两季，6-9月为高峰期。该病发病前数天，在喉咙部位与粪便就可发现病毒，此时即有传染力，发病后一周内传染力最强;而患者可持续经由肠道释放出病毒，时间长达8-12周之久。潜伏期为2-10天，平均约3-5天。发病初期，没有明显的前期症状，多数病人突然起病，约半数病人于发病前I?2d或发病的同时发热，多在38°C左右，有上感症状，如咳嗽、流涕、恶心、呕吐等等。发病后期手、足、口、臀四个部位出现疱疹。与疱疹性咽峡炎、疱疹性龈口炎及口蹄疫也很相似，儿童一旦出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症就很难治愈。因此，在临床上早期诊断就显得尤为重要。目前还没有资料显示临床检测手足口病的试剂盒。临床检验主要以细胞接种、乳鼠接种、血清中和试验和RT-PCR方法进行诊断，这些方法耗时长，检测成本高、RT-PCR常会有假阳性结果，给临床早期诊断带来了一定的困难。
[0005]胶体金法，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记，该技术使用方便快速，所有反应能在15分钟内完成;成本低，不需要特殊的仪器设备;应用范围广，可适应多种检测条件;标记物稳定，标记样品在4°C贮存两年年以上，无信号衰减现象;胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。检测标本种类多:可用于查血、尿液或粪便，因而适合各种检查。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的制备方法，所得试纸以胶体金标记EV71与CA16单抗制备二联金标试纸条，可应用于临床手足口病的早期诊断和筛查，为该病的治疗提供最佳的治疗时机，使更多的婴幼儿远离该病的威胁。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0008]手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的制备方法，包括如下步骤:
[0009]S1、用去离子水将Iml I %氯金酸稀释至0.01 % 10ml，加热至95°C，稳定23min，快速加入1%的柠檬酸三钠lmL，反应至颜色呈酒红色，稳定3min后取出，继续搅拌至室温；
[0010]S2、在pH为8.0的条件下，将0.2mg/ml抗体与胶体金溶液以I: I比例混合，室温反应30111；[11，按每毫升加入10%1334 600111的剂量，封闭30111；[11，4°(^120001'/111；[11离心30111；[11，弃上清液，沉淀物用ImL TBS混匀，4°C 12000r/min，离心30min，弃上清液，0.1mL TBS重悬，避光保存备用；
[0011]S3、在硝酸纤维素膜上进行检测线胶体金标记抗体、质控线抗体的喷涂，检测线分别为EV71单抗lmg/mL、CA16单抗lmg/mL;质控线为羊抗鼠抗体lmg/mL;
[0012]S4、将样品垫、结合垫、所得硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在带有黏合剂的PVC背板上，切成4mm宽的试纸，室温干燥。
[0013]本发明具有以下有益效果:
[0014]不仅能提供方便、高效的检测手段，而且弥补了市场上只能检测手足口病单一病原体的缺陷。大大降低了临床检测费用，便于在基层医院普及，为手足口病的防控和治疗提供了有利的依据。
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的结构示意图。
【具体实施方式】
[0016]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0017]实施例
[0018](I)胶体金溶液制备
[0019]用去离子水将Iml 1%氯金酸稀释至0.01%100ml，加热至95°C，稳定23min，快速加入1%的柠檬酸三钠lmL，反应至颜色呈酒红色，稳定3min后取出，继续搅拌至室温在电镜下观察制备的胶体金颗粒直径大小。
[0020](2)胶体金标记抗体最佳条件的优化
[0021]A:金标抗体最适pH的测定
[0022]取相同量的胶体金溶液放入1.5mL离心管中，用0.lmol/LK2⑶3调pH至8.0，取酶标板8孔，分别加不同pH的胶体金200ul铺底，每孔再分别加单抗1ul，震荡反应30min后，每孔加10%NaCl溶液20ul，震荡反应15min后，用酶标仪检测在520nm波长OD值最高的那一点pH为最适的pH。
[0023]B:金标抗体的最佳浓度确定
[0024]将抗体稀释至0.2mg/mL，取酶标板，每孔200ul胶体金铺底，取不同体积4H8、10B2单抗分别加入，去离子水补足体积，震荡反应30min后，每孔加10%NaCl溶液20ul，震荡反应15min，胶体金与抗体达到最低稳定量的各孔仍保持红色不变，同时用酶标仪检测在520nm波长条件下，OD值稳定的含抗体的最低孔即为200ul胶体金所需抗体的量。
[0025]C:金标抗体的制备
[0026]在pH为8.0的条件下，将0.2mg/ml抗体与胶体金溶液以1:1比例混合，室温反应30111；[11，按每毫升加入10%1334 600111的剂量，封闭30111；[11，4°(^120001'/111；[11离心30111；[11，弃上清液，沉淀物用ImL TBS混匀，4°C 12000r/min，离心30min，弃上清液，0.1mL TBS重悬，避光保存备用；
[0027]在硝酸纤维素膜上进行检测线胶体金标记抗体、质控线抗体的喷涂，检测线分别为EV71单抗lmg/mL、CA16单抗lmg/mL;质控线为羊抗鼠抗体lmg/mL;
[0028]二联夹心试纸的组装
[0029]将样品垫、结合垫、所得硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在带有黏合剂的PVC背板上，切成4_宽的试纸，室温干燥。
[0030]金标试纸条的检测与结果判断
[0031]将ELISA检测为阳性的样品，取60ul样品滴加到胶体金试纸条的样品垫上，15min后观察结果，检测线和质控线均出现红线为阳性，仅质控线出现红线为阴性，如质控带未出现则为失效。比较金标试纸检测的准确率。
[0032]所得手足口病EV71与CA16 二联诊断金标试纸如图1所示，包括PVC底板，所示PVC底板上顶面从左往右依次设有样品垫、NC膜(硝酸纤维素膜)和吸水滤纸，所述NC膜(硝酸纤维素膜)上端从左往右依次设有含EV71+CA16单抗的胶体金垫、Tl线(EV71抗体)、T2线(CA16抗体)和控制线(C线)，且含EV71+CA16单抗的胶体金垫一侧位于样品垫一侧的下方。
[0033]我们在临床收集了326份疑似血清样本，同时用间接ELISA和二联金标试纸条检测EV71和CA16，结果表明两种检测方法的检出率一致。用间接ELISA方法8小时左右检测完样本，而试纸条仅用了 45分钟完成了所有样本的检测。
[0034]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.手足口病EV71与CA16二联诊断金标试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: S1、用去离子水将ImlI %氯金酸稀释至0.01% 10ml，加热至95°C，稳定23min，快速加入1%的柠檬酸三钠lmL，反应至颜色呈酒红色，稳定3min后取出，继续搅拌至室温； S2、在pH为8.0的条件下，将0.2mg/ml抗体与胶体金溶液以1:1比例混合，室温反应.30111；[11，按每毫升加入10%1334 600111的剂量，封闭30111；[11，4°(^120001'/111；[11离心30111；[11，弃上清液，沉淀物用ImL TBS混匀，4°C 12000r/min，离心30min，弃上清液，0.1mL TBS重悬，避光保存备用； S3、在硝酸纤维素膜上进行检测线胶体金标记抗体、质控线抗体的喷涂，检测线分别为EV71单抗lmg/mL、CA16单抗lmg/mL;质控线为羊抗鼠抗体lmg/mL; S4、将样品垫、结合垫、所得硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在带有黏合剂的PVC背板上，切成4_宽的试纸，室温干燥。
【文档编号】G01N33/577GK105842452SQ201610379556
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】张丽颖, 卢春燕
【申请人】吉林大学