基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法
【专利摘要】本发明提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，包括以Fe3O4纳米颗粒为固相载体，制备出表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的免疫磁性颗粒，将DNMT1标准品或待测样品采用所述免疫磁性颗粒捕获并富集分离，然后向分离后所得的产物中加入被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，使抗体与待测抗原结合，采用多功能微孔板读数仪以270 nm激发下进行荧光检测，根据荧光强度与DNMT1标准品或待测样品浓度的关系建立回归方程。该方法步骤简单且由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。
【专利说明】
基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及检测技术领域，具体的说，涉及了一种基于量子点荧光免疫检测DNMTl 的方法。
【背景技术】
[0002] 在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已 经以"双抗夹心"为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如:放射免疫法、酶联免疫法、化学 发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定 量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通 常作法是:将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原（目标蛋白）反应，洗涤后再与标记抗体 反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工 洗涤的烦琐，但存在固相载体的分离效率较低、检测精度不高等缺点。
[0003] 为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种以纳米固相颗粒为载体，具 有分离效率高、检测精度高且具有高度特异性的基于量子点荧光免疫检测DNMTl的方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于量子点荧光免疫检测 DNMTl的方法，具体步骤包括： 提供一种表面被·MTl单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为 Fe3〇4@McAb; 提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记作为QD sOPcAb; 将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4麵cAb与经I3BS缓冲液稀释后的DNMTl标准样或待测 目标物进行温育反应50 min~60 min，使得所述DNMTl标准样或待测目标物被Fe3〇4@McAb捕 获、富集分离； 然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDsOPcAb与被Fe3O4OMcAb捕获、富集分离的所述 MT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min~130 min，使得所述QDsOPcAb与所述 DNMTl标准样或待测目标物相结合;经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定 270 nm激发下反应产物的荧光强度； 根据检测的荧光强度与所述DNMTl标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检 测DNMTl的回归方程。
[0006] 需要说明的是，上述各步骤中，CB代表碳酸盐缓冲液、PBS代表磷酸盐缓冲溶液、 PBST代表添加 Tween-20非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液。
[0007] 基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，还包括采用ELISA法检测 提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步骤。
[0008] 基于上述，提供一种所述Fe3〇4@McAb的步骤包括： (1) 清洗:将Fe3〇4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为O. Ol mol/ L~0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min~5 min，然后进行磁分离弃上清得 到第一沉淀物。其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL EDC溶液和浓度为 8 mg/mL~11 mg/mL NHS溶液进行祸旋反应10 min~15 min，磁分离、弃上清处理后采用 MES缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物。其中，EDC代表 (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺溶液、MES 代表吗啉乙磺酸缓冲液、mg/mL代表毫克每毫升； (3) 缓冲体系转换:采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3~4次次，磁分离得到第三 沉淀物； (4) 偶联：向所述第三沉淀物中加入D匪Tl单克隆抗体和I3BS缓冲液进行涡旋反应1.5h ~2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀 物； (5) 封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5h~Ih，磁分离、弃上 清处理后，采用PBST缓冲液清洗3~4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe 3O4麵cAb;其中 BSA封闭液代表牛血清白蛋白封闭液； (6) 保存:在偶联产物?63〇4麵〇413中加入?83缓冲液，轻晃摇匀，4°(：保存备用。
[0009] 基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法中，采用ELISA法检测提供 的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步骤包括： (1) 将经浓度为45 mmol/L~50 mmol/L、pH为9·0~9·6的CB缓冲液稀释的Fe3O4OMcAb 加入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板;其中mmol/L代表毫摩尔每升； (2) 采用I3BS缓冲液配制浓度为300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1标准品，并将其加入上 述酶标板中，恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗 所述酶标板;其中ng/mL代表纳克每毫升； (3) 采用封闭液将DNMTl多克隆抗体稀释400~500倍，然后将其以每孔100微升加入到 所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (4) 用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000~5000倍，以每孔100微升将其加入 到所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (5 )将TMB显色剂A液和B液等体积混合，将其加入到所述酶标板中，35 °C~37 °C避光温 育反应15 min~20 min;显色反应后，向所述酶标板中加入H2SO4终止液，并立即在酶标仪上 检测各孔的吸光度0D，其中，检测波长为450 nm。
[0010] 基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMTl的方法，还包括采用夹心法检测提 供的所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性的步骤。
[0011] 基于上述，基于量子点荧光免疫检测DNMTl的方法，其特征在于，提供一种所述 QDsOPcAb的步骤包括： 将pH为7.0~7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升~1微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL~I mg/mL的·MTl多克隆抗体，每次 加入上述物质后均需振荡混匀;其中、mg/mL代表毫克每毫升； 然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下涡旋反 应1.5h~2h，反应结束后向所述PE管中加入含0.5%质量百分数BSA封闭液的PBS缓冲液，在 18°C~25°C下涡旋反应20 min~30 min; 所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4°C保存，从而制得所述QDsO PcAb0
[0012] 基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMTl的方法中，采用夹心法检测提供的 所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性的步骤包括:将经浓度为45 mmol/L~50 mmol/L、pH 为9.0~9.6的CB缓冲液稀释的QDsOPcAb加入到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min~90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功微 孔板读数仪上测荧光强度。
[0013] 基于上述，所述的一种基于量子点焚光免疫检测DNMTl的方法，还包括将上述各步 骤中各参数的优化的步骤，然后根据优化参数建立检测DNMTl的回归方程，其中，在DNMTl标 准品浓度为5 ·0 ng/mL~1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Y=O ·00775X+20 · 77161， 其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMTl标准品浓度，相关系数r为0.9873;在·ΜΤ1标准品浓度为 0 · I ng/mL~5 · 0 ng/mL范围内，本方法检测DNMTl的回归方程为Y=O · 02779X+1 · 29858，其中 Y代表1gRFU，X代表1gDNMTl，相关系数r为0.9877。
[0014]基于上述，所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，对·ΜΤ1浓度的最低检 测限为0.1 ng/mL。
[0015] 本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明将 Fe3O4纳米颗粒的快速分离技术、免疫反应的高度特异性和量子点的高荧光强度有机结合起 来，根据检测的荧光强度与所述·ΜΤ1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测 D匪Tl的回归方程，从而利用该方法计算样品中DNMTl的含量，方法步骤简单且由该方法建 立的回归方程对·ΜΤ1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异 性。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的Fe3〇4@McAb的生物活性检测结果图。
[0017] 图2是本发明QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性检测结果图。
[0018] 图3是本发明不同稀释倍数的Fe3〇4@McAb捕获抗原时与反应体系荧光强度关系图。 [0019]图4是本发明QDsOPcAb复合物浓度与反应体系荧光强度关系图。
[0020]图5是本发明免疫缓冲液种类与反应体系荧光强度关系图。
[0021]图6是本发明固相抗体捕获抗原作用时间与反应体系荧光强度关系图。
[0022]图7是本发明QDsOPcAb与抗原的作用时间对反应体系荧光强度关系图。
[0023]图8是本发明建立的低浓度DNMTl检测标准曲线示意图。
[0024]图9是本发明建立的高浓度DNMTl检测标准曲线示意图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过【具体实施方式】，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
[0026] 本发明中所用的试剂种类如下：·ΜΤ1抗原(OriGene)，·ΜΤ1单克隆抗体(北京博 奥龙免疫技术有限公司），DNMT1多克隆抗体(ABclonal)，Fe3〇4纳米颗粒（自制），CdSe/ZnS量 子点（武汉珈源量子点公司），人DNA甲基化转移酶3a ELISA试剂盒、人DNA甲基化转移酶3b ELISA试剂盒(上海康朗生物科技有限公司），HRP标记的山羊抗兔IgG，牛血清白蛋白（BSA， 北京索莱宝科技有限公司），其他试剂均为分析纯，实验用水Milli-Q超纯水（电阻率大于 18.2 ΜΩ . cm)〇
[0027]本发明中所用的仪器如下：多功能微孔板读数仪(SpectraMax M2e，美国），电热恒 温培养箱(DHG-9080型，上海精宏实验设备有限公司），数控超声波清洗仪(KQ-300DE型，昆 山市超声仪器有限公司），可调微量加样器(Eppendorf，德国），XH-C型涡旋混匀仪(金坛市 国旺实验仪器厂），低温离心机(Centrifuge 5424 R，Eppendorf) 〇 [0028]本发明提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMTl的方法，具体步骤包括： 提供一种表面被·MTl单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为 Fe3〇4iMcAb;并采用ELISA法检测提供的所述Fe3〇4@McAb的生物活性； 提供一种的被量子点标记的DNMTl多克隆抗体溶液，记作为QDsOPcAb;并采用夹心法检 测提供的所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性； 所述Fe3O4麵cAb经CB缓冲液稀释后加入到黑色96孔板中，并向其中加入经I3BS缓冲液 稀释的·ΜΤ1抗原进行恒温孕育50 min~60 min;然后向所述黑色96孔板中加入经I3BST缓 冲液稀释后的所述QDsOPcAb进行温育反应110 min~130 min，最后向所述黑色96孔板中 加入PBST，在多功能微孔板读数仪上测定荧光强度;然后根据优化后的参数得到的荧光强 度与所述·ΜΤ1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测·ΜΤ1的回归方程。其 中，每次温育反应后均需对所述黑色96孔板进行磁分离和PBST洗板处理。建立检测DNMTl的 回归方程，其中，在·ΜΤ1标准品浓度为5.0 ng/mL~1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程 为Y=0.00 775X+20.77161，其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMTl标准品浓度，相关系数r为 0.9873;在在·ΜΤ1标准品浓度为0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范围内，本方法检测DWTl的回归 方程为Y=0.0 2779X+1.29858，其中Y代表1gRFU，X代表1gDNMTl，相关系数r为0.9877。
[0029] 其中，提供一种所述Fe3〇4@McAb的步骤包括： (1) 清洗:将Fe3〇4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为0.01 mol/ L~0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min~5 min，然后进行磁分离弃上清得 到第一沉淀物，其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL EDC溶液和浓度为 8 mg/mL~Ilmg/mL NHS溶液进行祸旋反应10 min~15 min，磁分离、弃上清处理后采用MES 缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物，其中，EDC代表（ΙΟ-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、 NHS 代表 N-羟基琥珀酰亚胺溶液、 MES 代表 吗啉乙磺酸缓冲液； (3) 缓冲体系转换:采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3次，磁分离得到第三沉淀 物； (4) 偶联：向所述第三沉淀物中加入D匪Tl单克隆抗体和I3BS缓冲液进行涡旋反应1.5h ~2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀 物； (5) 封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5h~Ih，磁分离、弃上 清后采用I3BST缓冲液清洗3次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe 3O4麵cAb，其中BSA封闭 液代表牛血清白蛋白封闭液； (6) 保存:在偶联产物?63〇4麵〇413中加入?83缓冲液，轻晃摇匀，4°(：保存备用。
[0030] 采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4麵CAb的生物活性，检测结果如图1所示，图中显 示DNMTl空白对照组具有较高的背景值，但低于实验组吸光度，同时可证明在Fe 3O4纳米颗粒 表面成功修饰了 DNMTl单克隆抗体且不影响抗体活性。具体检测步骤包括： (1) 将经浓度为45 mmol/L~50 mmol/L、pH为9·0~9·6的CB缓冲液稀释的Fe3O4OMcAb 加入到酶标板中，每孔加入量为100微升，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板拍干备 用； (2) 采用I3BS缓冲液配制浓度为300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1标准品，并将其加入上 述酶标板中，每孔加入量为100微升，恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理 并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板； (3) 采用封闭液将DNMTl多克隆抗体稀释400~500倍，然后将其以每孔100微升加入到 所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (4) 用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000~5000倍，以每孔100微升将其加入 到所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (5) 将TMB显色剂A液和B液等体积混合，以每孔100微升将其加入到所述酶标板中，35 °C~37°C避光温育反应15~20 min;显色反应后，向所述酶标板中每孔加入50微升的浓度 为2 mol/L H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测各孔的吸光度0D，其中，检测波长为450 nm〇
[0031] 其中，提供一种所述QDsOPcAb的步骤包括： 将pH为7.0~7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升~1微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL~I mg/mL的·MTl多克隆抗体，每次 加入上述物质后均需振荡混匀； 然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下涡旋反 应1.5 h~2 h，反应结束后向所述PE管中加入含0.5%质量百分数BSA封闭液的PBS缓冲液， 在18°C~25°C下涡旋反应20 min~30 min; 所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4°C保存，从而制得所述QDsO PcAb0
[0032]采用夹心法检测提供的所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性，结果如图2所示，空 白对照为·ΜΤ1抗原空白，体系荧光强度随QDsOPcAb稀释比增大而降低，但均高于空白对 照，说明QDsOPcAb偶联产物制备成功，且标记量子点后抗体的活性依然存在。具体检测步骤 包括:将经浓度为45臟〇1/1~50 111111〇1/14!1为9.0~9.6的08缓冲液稀释的008即〇413加入 到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min~90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗 所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功能微孔板读数仪上测荧光强度。
[0033]由此可见，本发明提供的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法中对最终检测精 度影响因素比较多，比如:Fe3〇4麵cAb稀释比、QDsOPcAb稀释比、免疫反应缓冲液种类、固相 抗体捕获抗原作用时间、QDsOPcAb作用时间等。
[0034] 下面就这些影响因素，对本发明提供的基于量子点荧光免疫检测MMTl的方法作 进一步的阐述。
[0035] 一、Fe3〇4@McAb 稀释比优化 为得到Fe3O4麵cAb的最优用量，实验考察了不同稀释倍数的Fe3O 4OMcAb捕获抗原时对 反应体系荧光强度的影响，结果如图3所示，反应体系荧光强度随稀释倍数的增大先增加后 迅速降低，在Fe3O 4麵cAb稀释比为1:50时荧光强度达到最大，其原因是Fe3O4纳米颗粒对量 子点的荧光有淬灭作用，当Fe 3O4OMcAb浓度过高时，Fe3O4纳米颗粒对量子点的荧光淬灭作 用增强，此外Fe 3O4纳米颗粒自身的黑色对荧光也有掩蔽作用。因此选择Fe3O4OMcAb的最优 稀释比为1:50。
[0036] 二、QDsOPcAb 稀释比优化 QDsOPcAb作为FLISA方法的荧光信号来源，其用量与方法灵敏度和线性范围等密切相 关，因此实验考察了QDsOPcAb复合物浓度对反应体系荧光强度的影响，结果如图4所示，随 QDsOPcAb复合物浓度的增加，反应体系荧光强度先增加后逐渐趋于稳定，在QDsOPcAb复合 物稀释比为1: :30时荧光强度较高，且当继续增加QDsOPcAb复合物浓度时，体系荧光强度增 加不明显，因此选择QDsOPcAb复合物的最佳稀释比为1:30。
[0037]三、免疫反应缓冲液种类优化 免疫缓冲液对反应体系的荧光强度也有一定的影响，实验选择常用的四种缓冲液浓度 为0.01 mol/L、pH 7.4的PBS，浓度为0.01 mol/L、pH 7.4的PBST，浓度为0.01 mol/L、pH 7 的BS，浓度为0.05 mol/L、pH 9.6的BC进行考察，结果如图5所示，体系荧光强度从大到小对 应的缓冲液分别为PBST、PBS、BS和CB，原因是CB缓冲液pH较高，对量子点的稳定性可能造成 一定的影响，PBST与PBS相比添加了表面活性剂Tween-20,其能够提高溶液中量子点的分散 性，减少因量子点团聚而造成的荧光淬灭。因此选择最佳的免疫反应缓冲液为PBST。
[0038] 四、固相抗体捕获抗原作用时间优化 实验对固相抗体捕获样品中待测抗原的作用时间进行考察，结果如图6所示，固相抗体 与抗原作用时间为60 min时反应已达到平衡，体系荧光强度最高，因此选择最佳抗原作用 时间为60 min。
[0039] 五、QDsOPcAb作用时间优化 实验对量子点标记抗体QDsOPcAb与抗原的作用时间进行考察，结果见如7所示，随时间 增加，体系荧光强度逐渐增大，120 min达到最大后下降，因此选择QDsOPcAb的作用时间为 120 min〇
[0040] 六、标准曲线的建立 用PBS将DNMTl标准品配制成浓度范围为0.001 ng/mL~1500 ng/mL的试样，按照优化 后的最优实验条件进行检测，每个浓度平行测定3次，将样品孔荧光值记为RFU。实验中发现 对于不同DWTl浓度范围，荧光值与DWTl浓度的关系不同，因此，采用分段的方法绘制标准 曲线。
[0041 ] 在DNMTl浓度为5.0 ng/mL~1500 ng/mL范围内，以DNMTl标准品浓度(Cdnmti)为横 坐标，荧光值RFU为纵坐标绘制标准曲线如图8所示，在5.0~1500 ng/mL范围内，本方法检 测DNMTl 的回归方程为Y=0.00 775X+20.77161 (Y为RFU，X为Cdnmti)，相关系数r为0.9873。 [0042] 在·ΜΤ1浓度为0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范围内，对·ΜΤ1浓度以及相应的荧光值 RFU取对数，以DNMTl标准品浓度的对数（IgC)为横坐标，荧光值RFU的对数（IgRFU)为纵坐标 绘制标准曲线如图9所示，在0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMTl的回归方程 为Y=O · 02779X+1 · 29858(Y为IgRFU，X为IgCDNMTi)，相关系数r为0 · 9877。
[0043]七、该方法检测条件的确立： 7.1检獅艮 取浓度分别为0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL的8个低浓度区的DNMTl试样按照上述检测方法进行检测，结 果见表7.1，同时检测6个·ΜΤ1抗原空白的样品，X为16.131，SD为0.996，求出X+3SD的值为 19 · 119，RFU(q.5)>19 · 119，因此该方法的检测限为0 · I ng/mL。
[0044] 表7.1低浓度DNMTl试样检测结果
7.2精密度 板内和板间精密度的测定结果见表7.2，对于高、中、低三个浓度的样品，板内精密度相 对标准偏差(RSD)的范围为5.45%~11.29%，板间精密度RSD的范围为7.03%~11.25%因此该 方法的检测限为0.1 ng/mL板内加标回收率的范围为91.67%~106.50%，板间加标回收率的 范围为92 · 18% ~108 · 50%。
[0045]表7.2板内和板间精密度(n=3)
7.3准确度 板内和板间的回收率的测定结果见表7.3,对于高、中、低三个浓度的标准品，板内加标 回收率的范围为91.67%~106.50%，板间加标回收率的范围为92.18%~108.50%。
[0046]表7.3板内和板间回收率
7.4特异性 由于FLISA将用于血清中·ΜΤ 1检测，血清成分复杂，要求FLISA对·ΜΤ 1具有较高的特 异性，因此采用血清中与DNMTl结构相似的·MT3a和·MT3b对方法的特异性进行考察，将测 得的样品荧光强度带入标准曲线Y=0.02779X+1.29858(Y为lgRFU，X为lgC DNMTi)，计算得到相 当于DNMTl的量，结果见表7.4,从表中可以看出DNMT3a和DNMT3b对FLISA的交叉反应率分别 为4.0%和9.4%，交叉反应率低，表明FLISA法用于检测DNMTl特异性好。
[0047] 表7.4 FLISA测定DNMTl的特异性
[0048] (8 )、该方法检测结果验证试验： 将实验中建立的FLISA回归曲线方程应用于血清样品中DNMTl含量的检测，并将检测结 果与实验室建立的ELISA和MELISA进行比较，同时以商品ELISA试剂盒的检测结果对三种方 法进行评价。此外，在血清样品中加入一定浓度的·ΜΤ1标准品，用所建立的方法进行测定， 计算加标回收率。
[0049] 8.1血清样本收集与处理 血清样本均取自郑州大学第一附属医院呼吸与重症科室。所有血清样本均在患者晨起 空腹状态下采集，抽取静脉血3mL，置于非抗凝管内，37 °C水浴30min，3000r/min离心5min， 分离血清存于干燥冻存管中密封，置于-80°C冰箱备用。弃去有溶血现象的血清样本。
[0050] 8.2血清中DNMTl含量检测 取30例血清样品，用FLISA、ELISA和MELISA法检测血清中DNMT1含量，并与商品ELISA试 剂盒检测结果进行对比。
[0051 ] 8.3血清样品加标回收率和精密度 分别在血清样品中加入高、中、低（1000 ng/mL、500 ng/mL、50 ng/mL)三个浓度的 DNMTl标准品，测定加标样品的荧光强度或吸光度，同时检测未加标血清的荧光强度或吸光 度，每个样品平行测定3次，根据公式4.1计算加标回收率，同时计算相应的相对标准偏差。 [0052] 表8.1 FLISA对血清中DNMTl含量的检测结果
[0053] 用SPSS 21.0对以上检测结果进行统计分析，FLISA、ELISA以及商品ELISA试剂盒 的检测结果均符合正态分布，分别将FLISA和商品ELISA试剂盒的检测结果、ELISA和商品 ELISA试剂盒的检测结果进行配对样本t检验，结果前者t=l. 913、P=0.233，后者t=0.256、P= 0.927,两组数据P值均大于0.05,说明实验中建立的FLISA、ELISA方法与商品ELISA试剂盒 对血清中DNMTl含量检测结果的差异无统计学意义。
[0054]因此，由该方法建立的回归方程对·MT 1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准 确度高且具有良好的特异性。
[0055]最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽 管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解:依然 可以对本发明的【具体实施方式】进行修改或者对部分技术特征进行等同替换;而不脱离本发 明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
【主权项】
1. 一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括： 提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3〇4纳米免疫磁性颗粒，记为Fe3〇4@ McAb ； 提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记为QD sOPcAb; 将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3〇4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的·MT1标准样或待测目 标物进行温育反应50 min~60 min，使得所述·ΜΤ1标准样或待测目标物被Fe3〇4麵cAb捕 获、富集分离； 然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDsOPcAb与被Fe3〇4@McAb捕获、富集分离的所述 MT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min~130 min，使得所述QDsOPcAb与所述 DNMT1标准样或待测目标物相结合;经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定 270 nm激发下反应产物的荧光强度； 根据检测的荧光强度与所述·ΜΤ1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检 测DNMT1的回归方程。2. 根据权利要求1所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，它还包 括采用ELI SA法检测提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步骤。3. 根据权利要求1或2所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供 一种所述Fe3〇4麵cAb的步骤包括： (1) 清洗:将Fe3〇4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后，采用浓度为0.01 mol/ L~0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2min~5 min，然后进行磁分离、弃上清处 理得到第一沉淀物； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液和浓度 为8 mg/mL~11 mg/mL的NHS溶液进行祸旋反应10 min~15 min，经磁分离、弃上清处理后， 采用MES缓冲液对其洗涤3~4次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物； (3) 缓冲体系转换:采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3~4次次，磁分离得到第三 沉淀物； (4) 偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和roS缓冲液进行涡旋反应1.5 h ~2 h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀 物； (5) 封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5 h~1 h，磁分离、弃 上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3~4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3〇4麵cAb; (6) 保存:在Fe3〇4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4°C保存备用。4. 根据权利要求3所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，采用 ELI SA法检测提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步骤包括： (1) 将经浓度为45 mmol/L~50 mmol/L、pH为9 · 0~9 · 6的CB缓冲液稀释的Fe3〇4iMcAb加 入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板拍干备用； (2) 采用roS缓冲液配制浓度为300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1标准品，并将其加入上 述酶标板中，恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗 所述酶标板； (3) 采用封闭液将·ΜΤ1多克隆抗体稀释400~500倍，然后将其以每孔100微升加入到 所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (4)用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000~5000倍，以每孔100微升将其加入 到所述酶标板中，35°C~37°C恒温箱中温育80 min~90 min，然后进行磁分离处理并采用 PBST缓冲液清洗所述酶标板； (5 )将TMB显色剂A液和B液等体积混合，将其加入到所述酶标板中，35 °C~37 °C避光温 育反应15~20min;显色反应后，向所述酶标板中加入H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测 各孔的吸光度OD，其中，检测波长为450 nm。5. 根据权利要求4所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，它还包 括采用夹心法检测提供的所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性的步骤。6. 根据权利要求5所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，提供一 种所述QDsOPcAb的步骤包括： 将pH为7.0~7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升~1微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL~1 mg/mL的·MT1多克隆抗体，每次 加入上述物质后均需振荡混匀； 然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下涡旋反 应1.5 h~2 h，反应结束后向所述PE管中加入含质量百分数为0.5%~1.0%的BSA封闭液的 PBS缓冲液，在18°C~25°C下涡旋反应20 min~30 min; 所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4°C保存，从而制得所述QDs@ PcAb〇7. 根据权利要求6所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，采用夹 心法检测提供的所述QDsOPcAb的荧光强度及抗体活性的步骤包括： 将经浓度为45 mmol/L~50 mmol/L、pH为9.0~9.6的CB缓冲液稀释的QDsOPcAb加入到 黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min~90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所 述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功微孔板读数仪上测荧光强度。8. 根据权利要求7所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，它还包 括将上述各步骤中各参数的优化的步骤，然后根据优化参数建立检测DNMT1的回归方程，其 中，在DNMT1标准品浓度为5.0 ng/mL~1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Υ= 0.00775Χ+20.77161，其中，Υ代表荧光值RFU，X为DNMT1标准品浓度，相关系数r为0.9873;在 MT1标准品浓度为0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范围内，本方法检测·ΜΤ1的回归方程为Y= 0.02779Χ+1.29858，其中Υ代表lgRFU，X代表lgDNMTl，相关系数r为0.9877。9. 根据权利要求8所述的基于量子点荧光免疫检测·ΜΤ1的方法，其特征在于，该方法 对DNMT1浓度的最低检测限为0.1 ng/mL。
【文档编号】G01N33/577GK105842451SQ201610324656
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】吴拥军, 刘利娥, 熊亚敏, 玉崧成, 于斐, 何磊良, 屈凌波, 王华栋
【申请人】郑州大学