专利名称：单抗zuf10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种人骨髓间充质干细胞原代细胞的分离纯化及体外培养的新方法，该方法应用一种新制备的抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体，通过免疫分选的方法有效地从人骨髓单个核细胞中分离纯化间充质干细胞，并在体外培养扩增、诱导多向分化。
背景技术：
人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，是组织工程和再生医学理想的种子细胞。在国内外有大量骨髓MSCs基础及临床研究的报道，其在干细胞治疗的临床应用中有广阔的前景。
正常人骨髓中MSCs的含量很低，约104～105个单个核细胞中含有一个MSCs，为得到足够数量MSCs应用于基础及临床研究，需要有效地分离、纯化、体外培养扩增MSCs。目前常用的从骨髓中分离MSCs的方案主要有三种①根据骨髓MSCs的底物黏附特性来实现分离的贴壁筛选法；②根据MSCs与其他细胞的密度不同来分离的密度梯度离心法；③根据细胞表面的一些特殊标记，用各种单克隆抗体进行免疫分选，如正向免疫分选、负向免疫分选、以及联合分选。通过传统的贴壁培养的方法获得的原代人骨髓MSCs耗时长、细胞的异质性大，这使MSCs的基础研究及临床应用的推广受到限制。以细胞特异性表面分子为标记通过免疫分选的方法，可有效地富集骨髓中含量极少的MSCs，提高原代培养所得MSCs纯度。
以往人骨髓MSCs公认的表型特征不表达造血细胞的表面抗原，CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A(Glycophorin A)、T或B淋巴细胞的表面标志均为阴性；相对特异的表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。正向免疫分选的免疫标记多为SH2、STRO-1、低亲和力神经生长因子受体(low-affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)SH2是以人骨髓MSCs免疫小鼠获得的单克隆抗体，研究证实SH2识别CD105分子，同时CD105也表达于骨髓单核细胞、有核红细胞、部分淋巴细胞；STRO-1是以骨髓CD34+细胞免疫小鼠获得的人骨髓基质细胞新的单克隆抗体，但是通过STRO-1分选的骨髓细胞中含有大量的有核红细胞和一小部分B淋巴细胞；LNGFR表达于大部分骨髓基质细胞，但LNGFR并非骨髓MSCs特异性标记，其表达于人体多种器官的血管外膜，在骨髓单个核细胞中LNGFR+细胞约为2.3％。骨髓单个核细胞中MSCs含量极低，通过负向免疫分选可以有效地提高分选后细胞中MSCs的含量，有研究者以CD45和Glycophorin A为标记筛选获得的CD45-Glycophorin A-细胞群成份复杂，仍需进一步纯化。因此，上述免疫标记均难以成为直接分选人骨髓MSCs的理想标记。
迄今为止，国内外研究者一直通过多个表面分子联合标记，并结合细胞的自我更新和多向分化潜能的特性来鉴定人骨髓MSCs，MSCs单一的特异性表面分子仍在探寻中，这给MSCs的分离、纯化的实际应用带来了一定的困难。深入研究人骨髓MSCs的表型特征，将有助于有效地分离纯化人骨髓MSCs并进一步培养扩增，以促进其在干细胞治疗领域的临床应用。采用杂交瘤技术研究制备的新的抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUF10，通过免疫细胞化学及免疫荧光染色检测证实ZUF10与人骨髓MSCs结合的阳性率均大于99％，传代培养的MSCs稳定表达ZUF10抗原；ZUF10与人骨髓来源的细胞系无交叉反应；除骨髓组织外，ZUF10与人间充质组织和非间充质组织均无交叉反应。ZUF10是针对人骨髓MSCs的新的特异性单克隆抗体，与人骨髓MSCs反应具有高度的特异性和敏感性。
发明内容
ZUF10抗原稳定表达于人骨髓间充质干细胞(MSCs)原代细胞及体外传代培养的早期、晚期MSCs，是人骨髓MSCs一种新的理想的标记。本发明的目的是提供一种单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓MSCs的方法，是通过以下技术方案实现人骨髓MSCs原代细胞的分离纯化，即从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，用专利申请号为200510061032.3所公开的单克隆抗体ZUF10为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUF10抗原阳性的人骨髓MCSs，ZUF10抗原阳性细胞贴壁生长、呈梭形，在体外培养体系中培养5天左右细胞开始明显扩增，扩增传代后细胞表型检测显示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)阳性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达均为阴性，是均一的人骨髓MSCs。本发明方法获得的人骨髓MSCs具有较好的生长活性及增殖潜能，且细胞传代过程中ZUF10抗原稳定表达，并可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。
所述方法中，是通过采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque密度梯度离心分离获得骨髓单个核细胞。
所述方法中，是用专利申请号为200510061032.3所公开的单克隆抗体ZUF10，抗体亚型为IgG1，与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离获得ZUF10抗原阳性的人骨髓MSCs，分别将ZUF10抗原阳性细胞和阴性细胞接种于培养皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
所述方法中，ZUF10抗原阳性细胞，培养3天后接种的培养皿中出现梭形贴壁细胞，5天后细胞扩增明显，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养19～22天贴壁细胞80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养20天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则。
本发明的有益效果在于(1)以单一的抗人骨髓MSCs特异性单克隆抗体ZUF10为标记，通过正向免疫分选可以直接、快速地从人骨髓单个核细胞中分离纯化原代MSCs，缩短了原代细胞培养的时间，提高了人骨髓MSCs的分离培养的效率，有效地改善了采用传统的贴壁筛选法培养原代MSCs耗时长、细胞异质性大的缺陷，并保持原代MSCs的生物学特性，为研究和应用骨髓原代MSCs提供了一个有效的方法。
(2)MSCs在骨髓中的含量极低，以ZUF10为标记通过正向免疫分选可以获得纯度较高的原代MSCs，且具有较高的增殖和多向分化潜能，可在体外传代扩增，并可定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞，有助于人骨髓MSCs在组织工程、再生医学中的推广应用。
(3)ZUF10是一种新研制开发的抗人骨髓MSCs单克隆抗体，以单一的ZUF10为标记通过正向免疫分选可以获得表型均一的MSCs，单克隆抗体ZUF10相应的膜表面抗原在人骨髓MSCs体外培养传代扩增过程中稳定表达，为研究该表面分子在MSCs增殖及分化过程中的生物学意义并进一步完善对MSCs特性的认识提供了平台。
图1是以抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞和阴性细胞的原代培养。
图2是以ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养扩增第一代和第五代的生长曲线。
图3是以ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR及ZUF10抗原表达的流式细胞术分析图。
图4是诱导成骨分化后Von Kossa法染色图。
图5是诱导脂肪分化后油红O染色图。
图6是向神经元样细胞定向诱导分化后免疫细胞化学染色图。
具体实施例方式本发明结合实施例和附图作进一步说明。
实施例1单克隆抗体ZUF10免疫磁珠法分选原代人骨髓MSCs采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度离心分离获得骨髓单个核细胞，用专利申请号为200510061032.3所公开的单克隆抗体ZUF10(抗体亚型为IgG1)与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗(Miltenyi Biotec Inc.)孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离获得ZUF10抗原阳性的人骨髓MSCs，分别将ZUF10抗原阳性细胞和阴性细胞接种于培养皿，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
培养3天后接种ZUF10抗原阳性细胞的培养皿中出现梭形贴壁细胞，5天后细胞扩增明显，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养20天左右贴壁细胞约80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养20天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则，参见图1，其中A、B分别为阳性细胞培养9天、20天的形态学特征(×100)，C、D分别为阴性细胞养9天、20天<p>本发明的目的是提供一种消除刻蚀工艺过程中残余气体，并提高设备的生产率的工艺控制方法。
技术方案本发明是通过如下技术方案实现的一种消除刻蚀工艺过程中残余气体的控制方法，包括以下步骤在工艺结束时，可以同时关闭气体总阀门和各气体分阀门；在硅片开始硅片传送时，打开干泵阀门；利用干泵对气体总阀阀和各气体分阀门之间的管路进行残气抽除；在延续5秒～10秒后，关闭干泵及干泵阀门。
有益效果通过控制干泵阀的开闭及干泵的启动/停止，在工艺结束进行硅片传送时，同时进行残气抽除，可以节省用分子泵抽净残气的时间。经过改进，设备的生产率得到较大幅度提高，如表1所示。同时工艺效果与未改进控制流程之前的分子泵抽除残气方式相比几乎一致。
表1控制流程改变前后的生产率对比
图1为干法刻蚀机的基本反应腔室和气路结构；图2为干法刻蚀机的刻蚀气体控制的一般流程；图3为本发明消除刻蚀工艺过程中残余气体方法的流程；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，<p>实施例4以ZUF10为标记通过正向免疫分选获得的阳性细胞多向分化潜能体外培养传代的ZUF10抗原阳性的人骨髓MSCs接近70％融合时，更换培养液，加入成骨诱导培养液(Stem Cell Technologies Inc.)、脂肪诱导培养液(Stem Cell Technologies Inc.)、神经分化预诱导液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
经成骨诱导培养6天左右，约50％细胞形态发生变化，由原来的纺锤型变为立方型或多角型，10天后出现钙化斑点，随着诱导时间的延长，立方型或多角型细胞以及钙化斑明显增加，约12～18天细胞形成广泛均一的矿化结节样结构。培养18天后，Von Kossa法染色，可以见到染成棕黑色的细胞外基质钙盐沉积，结果参见图4，是以ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向成骨定向诱导分化，图为诱导成骨分化后Von Kossa法染色(×100)。
经成脂肪诱导培养1周后，细胞形态开始变成圆形或多角性，细胞排列无序，可观察到胞浆中出现高折光性的小脂滴，随着诱导时间的延长逐渐聚集成大的脂滴。培养20天后，油红O染色，脂滴为橙红色，结果参见图5，是以ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向脂肪定向诱导分化后油红O染色(×100)。
经神经分化预诱导24小时后细胞形态未见明显变化，更换含5mM硫代甘油的无血清LG-DMEM，在诱导后3～5小时中，大多数细胞变为典型的神经元样细胞，简单的双级细胞和复杂的多级细胞均有出现，多个神经元样细胞突起可相互延伸并形成网状。免疫组化染色分析，神经元样细胞的胞体及部分突起神经干细胞标志物Nestin、神经元标志物NSE、神经元标志物NF-M表达阳性、星形胶质细胞标志物GFAP表达阴性，结果参见图6，是以ZUF10为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向神经元样细胞定向诱导分化，其中A、B、C、D分别为诱导神经分化后用免疫细胞化学染色法检测神经干细胞标志物Nestin、神经元标志物NSE、神经元标志物NF-M、星形胶质细胞标志物GFAP的表达(×100)。
综上，以单一的抗人骨髓MSCs特异性单克隆抗体ZUF10为标记，通过正向免疫分选获得的ZUF10抗原阳性人骨髓MSCs可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。
权利要求
1.一种用单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法，其特征是通过以下步骤实现(1)从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，(2)用专利申请号为200510061032.3所公开的单克隆抗体ZUF10为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUF10抗原阳性的人骨髓间充质干细胞，(3)ZUF10抗原阳性细胞在体外培养体系中贴壁生长、呈梭形，培养5天左右细胞开始明显扩增，扩增传代后细胞表型检测显示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)阳性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达均为阴性，是均一的人骨髓间充质干细胞，并可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。
2.根据权利要求1所述的用单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法，其特征是所述步骤(1)是通过采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque密度梯度离心分离获得骨髓单个核细胞。
3.根据权利要求1所述的用单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法，其特征是所述步骤(2)是用专利申请号为200510061032.3所公开的单克隆抗体ZUF10，抗体亚型为IgG1，与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离ZUF10抗原阳性的人骨髓间充质干细胞，分别将ZUF10抗原阳性细胞和阴性细胞接种于培养皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
4.根据权利要求1所述的用单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法，其特征是所述步骤(3)分选获得的ZUF10抗原阳性细胞，培养3天后接种的培养皿中出现梭形贴壁细胞，5天后细胞扩增明显，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养19～22天贴壁细胞80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养20天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则。
全文摘要
本发明提供一种用单抗ZUF10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法，是从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，用单克隆抗体ZUF10为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUF10抗原阳性的人骨髓间充质干细胞。本发明方法获得的人骨髓间充质干细胞具有较好的生长活性及增殖潜能，且细胞传代过程中ZUF10抗原稳定表达，并可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。本发明提供的是一种较理想的人骨髓间充质干细胞分选纯化的方法，提高了原代间充质干细胞的纯度及分离培养的效率，有助于间充质干细胞生物学特性的研究及在临床检测和应用中的推广。
文档编号C12N5/08GK1850971SQ20061005076
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者黄河, 来晓瑜, 沈建根 申请人:浙江大学