专利名称：一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种利用大菱鲆鳍组织建立鳍细胞系的方法，即一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法。
背景技术：
近年来，我国的大菱鲆养殖规模越来越大，但传染性病毒病也随之开始广泛传播，致使大菱鲆的死亡率逐年上升，给大菱鲆养殖业造成了重大的经济损失。如何解决大菱鲆病毒病的预防和治疗问题，已成为当今世界上大菱鲆养殖业中急需解决的重要问题。在对海水养殖动物病毒病的预防和治疗研究中，学者们一致认为只有建立海水养殖动物连续性细胞系，才能从根本上查清病毒对海水养殖动物细胞的感染途径与感染机理，才能取得其病毒病治疗的最后成功；此外，利用该细胞系制备其特异性病毒疫苗，才能成功而有效地进行其病毒病的预防免疫。
在海洋生物中，尤其是在大菱鲆中，至今还没有通过建立相应细胞系来研究病毒的繁殖和感染机理以及大规模生产病毒疫苗的成功报道。因此，建立大菱鲆细胞系，是从根本上查清致病病毒对大菱鲆细胞的感染途径及其感染机理的前提条件，也是大菱鲆病毒疫苗研制和生产的关键之所在，必将为大菱鲆业带来巨大的经济效益。
发明内容
本发明的目的就是利用大菱鲆鳍组织，提供一种建立大菱鲆鳍细胞系的技术——一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法。
将活大菱鲆在加入了浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的消毒海水中暂养24小时，取出大菱鲆置70％酒精中浸泡1～2分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡30～60秒后，用L-15培养液清洗后放入消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成碎块装入已消毒离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％胰蛋白酶，混匀后酶解20～30分钟。将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％透明质酸酶和2毫升0.6％II型胶原酶，混匀酶解1～2小时后装入已消毒的离心管中，离心收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，分装至2个25毫升培养瓶中，正置干贴6小时后，每瓶补加4毫升鳍细胞专用增殖培养液，置20～22℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液一次。
所用大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液的配方为L-15培养液，20％胎牛血清，0.05‰～0.15‰羧甲基壳多糖，0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子和20％牙鲆鳃细胞培养液。
经这种方法所获得的传代大菱鲆鳍细胞可传60代以上，本发明所构建的大菱鲆鳍细胞系现已传至第62代。该细胞建系技术的主要特点是细胞系可以连续传代，能提供出大量的大菱鲆鳍细胞；细胞系细胞可直接应用于理论研究、病毒的繁殖以及病毒疫苗的研制；应用于大菱鲆病毒疫苗生产和养殖大菱鲆免疫的效益高、应用前景广阔。
具体实施例方式
作为实施例，本发明给出详细具体的制备和构建方法。
1、大菱鲆鳍组织的处理将活大菱鲆在加入了含青霉素1000单位/毫升和链霉素1000单位/毫升的消毒海水中暂养12～24小时。取出大菱鲆置70％酒精中浸泡1～2分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡30～60秒后，在消毒培养皿中用市售L-15培养液清洗2次，放入10毫升消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成1立方毫米大小的组织碎块。
2、大菱鲆鳍组织的酶解与游离细胞的获得将鳍组织剪碎物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％市售胰蛋白酶，混匀后酶解20～30分钟。将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％市售透明质酸酶和2毫升0.6％市售II型胶原酶，混匀后酶解1～2小时。
3、大菱鲆鳍细胞原代培养的启动将透明质酸酶和II型胶原酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心20分钟，收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液悬浮均匀后，分装至2个25毫升塑料培养瓶中，正置干贴6小时；每瓶补加4毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，置20～22℃生化培养箱中进行培养，观察并记录培养情况；每隔3～5天半量换液一次，即无菌取出2.5毫升旧培养液，再加入2.5毫升新的大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液。
4、大菱鲆鳍细胞的继代培养待大菱鲆鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的原培养液，向每个培养瓶中加入0.5毫升浓度为0.25～0.3％的胰蛋白酶溶液，静置酶解2～3分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入5毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，用滴管吹打培养瓶底3～5分钟制成大菱鲆鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升大菱鲆鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待大菱鲆鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例11、大菱鲆鳍组织的处理将活大菱鲆在加入了含青霉素1000单位/毫升和链霉素1000单位/毫升的消毒海水中暂养12小时。取出大菱鲆置70％酒精中浸泡1分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡30秒后，在消毒培养皿中用市售L-15培养液清洗2次，放入10毫升消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成1立方毫米大小的组织碎块。
2、大菱鲆鳍组织的酶解与游离细胞的获得将鳍组织剪碎物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％市售胰蛋白酶，混匀后酶解20分钟。将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％市售透明质酸酶和2毫升0.6％市售II型胶原酶，混匀后酶解2小时。
3、大菱鲆鳍细胞原代培养的启动将透明质酸酶和II型胶原酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心20分钟，收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液悬浮均匀后，分装至2个25毫升塑料培养瓶中，正置干贴6小时；每瓶补加4毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，置20℃生化培养箱中进行培养，观察并记录培养情况；每隔3天半量换液一次，即无菌取出2.5毫升旧培养液，再加入2.5毫升新的大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液。
4、大菱鲆鳍细胞的继代培养待大菱鲆鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的原培养液，向每个培养瓶中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置酶解2～3分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入5毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，用滴管吹打培养瓶底3～5分钟制成大菱鲆鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升大菱鲆鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待大菱鲆鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例21、大菱鲆鳍组织的处理将活大菱鲆在加入了含青霉素1000单位/毫升和链霉素1000单位/毫升的消毒海水中暂养24小时。取出大菱鲆置70％酒精中浸泡2分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡60秒后，在消毒培养皿中用市售L-15培养液清洗2次，放入10毫升消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成1立方毫米大小的组织碎块。
2、大菱鲆鳍组织的酶解与游离细胞的获得将鳍组织剪碎物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％市售胰蛋白酶，混匀后酶解30分钟。将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心15分钟，收集沉淀物用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％市售透明质酸酶和2毫升0.6％市售II型胶原酶，混匀后酶解1小时。
3、大菱鲆鳍细胞原代培养的启动将透明质酸酶和II型胶原酶酶解物装入已消毒的10毫升玻璃离心管中，1200转/分离心20分钟，收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液悬浮均匀后，分装至2个25毫升塑料培养瓶中，正置干贴6小时；每瓶补加4毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，置22℃生化培养箱中进行培养，观察并记录培养情况；每隔5天半量换液一次，即无菌取出2.5毫升旧培养液，再加入2.5毫升新的大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液。
4、大菱鲆鳍细胞的继代培养待大菱鲆鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的原培养液，向每个培养瓶中加入0.5毫升浓度为0.3％的胰蛋白酶溶液，静置酶解2～3分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入5毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，用滴管吹打培养瓶底3～5分钟制成大菱鲆鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升大菱鲆鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待大菱鲆鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
权利要求
1.一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法，首先将活大菱鲆在加入了浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的消毒海水中暂养24小时，取出大菱鲆置70％酒精中浸泡1～2分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡30～60秒后，用L-15培养液清洗后放入消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成碎块装入已消毒离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％胰蛋白酶，混匀后酶解20～30分钟，将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％透明质酸酶和2毫升0.6％II型胶原酶，混匀酶解1～2小时后装入已消毒的离心管中，离心收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，分装至2个25毫升培养瓶中，正置干贴6小时后，每瓶补加4毫升鳍细胞专用增殖培养液，置20～22℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液一次。
2.如权利要求1所述的细胞系的构建方法，其特征是所述的大菱鲆鳍细胞增殖培养液配方为L-15培养液，以及20％胎牛血清，0.1‰羧甲基壳多糖，0.1‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.1‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.015‰的人表皮细胞生长因子、0.015‰的人碱性成纤维细胞生长因子和20％的牙鲆鳃细胞的培养上清液。
全文摘要
一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法，它是以其胸鳍和腹鳍组织为材料，先将鳍组织剪碎，采用胰蛋白酶和透明质酸酶、II型胶原酶分步消化法获得游离鳍细胞和疏松组织块，在含20％胎牛血清、羧甲基壳多糖、N－乙酰葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、人表皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子和牙鲆鳃细胞培养液的L－15培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。该发明工艺科学合理，经这种方法所获得的传代细胞目前已传至第62代。本发明的大菱鲆鳍细胞未经任何病毒或癌基因转染，可望直接应用于相关理论研究和病毒疫苗的研制。
文档编号C12N5/071GK1793338SQ20051004518
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者樊廷俊, 丛日山, 耿晓芬, 王丽燕, 杨秀霞, 于秋涛, 李明玉, 付永锋 申请人:中国海洋大学