一种鸭黄病毒检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭黄病毒检测试剂盒，该试剂盒包括有鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条、终止液、阳性对照和阴性对照、酶结合物、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液A和显色液B。该检测试剂盒敏感性好、特异性高、准确可靠，可有效帮助养殖户减少损失、提高养殖效益。
【专利说明】一种鸭黄病毒检测试剂盒【技术领域】
[0001]本发明涉及鸭黄病毒检测【技术领域】，特别是涉及一种鸭黄病毒检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]鸭黄病毒(Bai yang dian virus,BYD)又名鸭坦布苏病毒，主要引起种鸭和蛋鸭食欲急剧减退、产蛋急剧下降，卵泡变性，卵泡膜出血为主要特征。
[0003]因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭黄病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。传统检测方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面存在一定劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种鸭黄病毒检测试剂盒。该检测试剂盒敏感性好、特异性高、准确可靠，可有效帮助养殖户减少损失、提高养殖效益。
[0005]本发明的一种鸭黄病毒检测试剂盒技术方案为，该试剂盒包括有鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条、终止液、阳性对照和阴性对照、酶结合物、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液A和显色液B。
[0006]鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条制备方法为:用pH8.5的0.05mol/LTris-HCl缓冲液作包被液，将鸭黄病毒E重组蛋白稀释为5 μ g/mL，按50-100 μ L/孔加Λ ELISA反应板中，37°C封闭2h，4°C包被过夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封闭l_3h，以含0.5%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，拍干，再加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保持2h。
[0007]所述样品稀释液为含0.05%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含0.5%吐温-20的0.5mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0008]所述酶结合物为羊抗鸡IgG。
[0009]所述显色液A为0.2mg/L的四甲基联苯胺溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
[0010]终止液为3mol/L硫酸溶液.阳性对照为经鸭黄病毒重组蛋白免疫获得的标准阳性血清，其0D450nm≥1.0，然后加入5mg/mL的链霉素，经无菌过滤后获得；阴性对照为SPF鸡标准阴性血清，其0D450nm(0.20,加入5mg/mL的链霉素,经无菌过滤后获得。
[0011]将待检血清用样品稀释液作1:500稀释，按25-100μ L/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，3 7 °C孵育3 O -6 Om i η ;弃去反应孔中的液体，每孔加经过纯水1:20稀释后的浓缩洗涤液200 μ L，洗涤5次，拍干；每孔加50-150 μ L的酶结合物工作液，.37°C孵育30-60min ;洗涤5次，拍干；依次加入50 μ L显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育1 5min ;加501^终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；阴阳临界值为0.40。
[0012]本发 明的有益效果为:本发明的一种鸭黄病毒检测试剂盒，敏感性好、特异性高、准确可靠，可有效帮助养殖户减少损失、提高养殖效益。
[0013]【具体实施方式】:
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案。
[0014]实施例1
试剂盒包括有鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条、终止液、阳性对照和阴性对照、酶结合物、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液A和显色液B。
[0015]鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条制备方法为:用pH8.5的0.05mol/LTris-HCl缓冲液作包被液，将鸭黄病毒E重组蛋白稀释为5 μ g/mL JPAELISA反应板中，37°C封闭2h，4°C包被过夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封闭2h，以含0.5%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，拍干，再加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保持.2h。
[0016]所述样品稀释液为含0.05%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含0.5%吐温-20的0.5mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0017]所述酶结合物为羊抗鸡IgG。
[0018]所述显色液A为0.2mg/L的四甲基联苯胺溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
[0019]终止液为3mol/L硫酸溶液.阳性对照为经鸭黄病毒重组蛋白免疫获得的标准阳性血清，其0D450nm≤1.0，然后加入5mg/mL的链霉素，经无菌过滤后获得；阴性对照为SPF鸡标准阴性血清，其0D450nm(0.20,加入5mg/mL的链霉素,经无菌过滤后获得。
[0020]将待检血清用样品稀释液作1:500稀释，按50 μ L/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37°C孵育30-60min ;弃去反应孔中的液体，每孔加经过纯水1:20稀释后的浓缩洗涤液200 μ L，洗涤5次，拍干；每孔加100 μ L的酶结合物工作液，37°C孵育.30-60min ;洗涤5次，拍干；依次加入50 μ L显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育.15min ΑΡδΟμ?终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；
应用本发明试剂盒对50份疑似鸭黄病毒感染病鸭的血清样品进行检测，阳性率达
.100% O
[0021]实施例2
试剂盒包括有鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条、终止液、阳性对照和阴性对照、酶结合物、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液A和显色液B。
[0022]鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条制备方法为:用pH8.5的0.05mol/LTris-HCl缓冲液作包被液，将鸭黄病毒E重组蛋白稀释为5 μ g/mL，按50-100 μ L/孔加Λ ELISA反应板中，37°C封闭2h，4°C包被过夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封闭l_3h，以含0.5%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，拍干，再加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保持2h。[0023]所述样品稀释液为含0.05%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含0.5%吐温-20的0.5mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0024]所述酶结合物为羊抗鸡IgG。
[0025]所述显色液A为0.2mg/L的四甲基联苯胺溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
[0026]终止液为3mol/L硫酸溶液.阳性对照为经鸭黄病毒重组蛋白免疫获得的标准阳性血清，其0D450nm≤1.0，然后加入5mg/mL的链霉素，经无菌过滤后获得；阴性对照为SPF鸡标准阴性血清，其0D450nm(0.20,加入5mg/mL的链霉素,经无菌过滤后获得。
[0027]将待检血清用样品稀释液作1:500稀释，按100μ L/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37°C孵育30-60min ;弃去反应孔中的液体，每孔加经过纯水1:20稀释后的浓缩洗涤液200 μ L，洗涤5次，拍干；每孔加100 μ L的酶结合物工作液，37°C孵育30-60min ;洗涤5次，拍干；依次加入50 μ L显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育15min ΑΡδΟμ?终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；
应用本发明试剂 盒对50份疑似鸭黄病毒感染病鸭的血清样品进行检测，阳性率达99.8%。
【权利要求】
1.一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条、终止液、阳性对照和阴性对照、酶结合物、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液A和显色液B。
2.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，鸭黄病毒E重组蛋白包被微孔反应板/条制备方法为:用PH8.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液作包被液，将鸭黄病毒E重组蛋白稀释为5 μ g/mL，按50-100 μ L/孔加入ELISA反应板中，37°C封闭2h，4°C包被过夜，拍干，用1%牛血清白蛋白37°C封闭l_3h，以含0.5%吐温-20的0.lmol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，拍干，再加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保持2h。
3.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.05%吐温-20的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含0.5%吐温-20的0.5mol/L ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物为羊抗鸡IgG0
5.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述显色液A为0.2mg/L的四甲基联苯胺溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，终止液为3mol/L硫酸溶液。
7.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为经鸭黄病毒重组蛋白免疫获得的标准阳性血清,其0D450nm> 1.0，然后加入5mg/mL的链霉素，经无菌过滤后获得；阴性对照为SPF鸡标准阴性血清，其0D450nm≤0.20，加入5mg/mL的链霉素，经无菌过滤后获得。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，将待检血清用样品稀释液作1:500稀释，按25-100μ!7孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37°C孵育30-60min ;弃去反应孔中的液体，每孔加经过纯水1:20稀释后的浓缩洗涤液200yL，洗涤5次，拍干；每孔加50-150 μ L的酶结合物工作液，37°C孵育30_60min ;洗涤5次，拍干；依次加入50μ L显色液A和50yL显色液B，37°C避光孵育15min ;加50^1^终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；阴阳临界值为0.40。
【文档编号】G01N33/569GK103675275SQ201310742908
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】翟庆贺, 李香云, 陈申秒, 贾红梅, 赵新彬 申请人:山东滨州博莱威生物技术有限公司