一种快速检测圆环病毒中具有细胞感染力病毒粒子含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物基因领域，特别涉及具有感染性圆环病毒粒子含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV)是已知最小的哺乳动物病毒之一，有两个 亚型，PCV1和PCV2,其中PCV1对猪无致病性，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主 要病原，是威胁全球养猪业的主要疫病之一。猪圆环病毒可W在猪巨瞻细胞、猪单核细胞等 细胞中复制。在体外，猪圆环病毒可W采用PK-15、IBRS-2细胞进行传代增值，但病毒在传 代过程中不产生细胞病变。不能在Vero细胞、BHK-21细胞、ST细胞等上生长。目前，猪圆 环病毒的检测方法主要有病毒分离、间接免疫英光试验、免疫过氧化物酶单层试验、PCR/英 光定量PCR、酶联免疫吸附试验等方法。由于该病毒不产生细胞病变，在疫苗生产和检定过 程中一般采用间接免疫英光试验进行病毒滴度测定。但该方法检测周期长，操作步骤复杂， 人为操作误差较大。PCR/英光定量PCR方法不能区分具有感染力和不具有感染力的病毒粒 子。目前，尚没有通过英光定量PCR方法区分有感染力和不具有感染力圆环病毒粒子的报 道。
【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的在于提供一种快速、定量测定具有感染力的圆环病毒粒子的实时英 光定量PCR方法。
[0004] 本发明的目的是通过如下技术方法实现的：
[0005] 1.本发明采用的用于检测猪圆环病毒含量的标准品，其中包含用于标准品片段扩 增的引物，用于圆环病毒检测的引物和英光探针（表1-1):
[0006] 表1-1相关引物探针参数
[0007]
[0008] 2.猪圆环病毒DNA的提取
[0009] 病毒DM提取采用商品化的病毒DM核酸提取试剂盒按操作说明书进行操作。病 毒DNA溶于灭菌蒸傭水或TE中，立即使用或-2(TC。
[0010] 3.标准品的制备
[0011] a.W圆环病毒DNA为模板，加入引物，通过聚合酶链式反应（PCR)扩增，预期扩增 大小约为1780bp。将扩增完毕的PCR产物电泳回收后，片段克隆到商品化T载体中，并进行 测序，确认克隆片段为圆环病毒目的基因片段。
[0012] b.使用微量紫外分光光度计测定出质粒的浓度，并经过计算，确定其拷贝数。
[0013] C.将确定拷贝数的质粒浓度液进行10倍体积的梯度稀释，从10 1倍稀释至10 12 倍，置于-2(TC低温保存。
[0014] 4.病毒样品前处理
[0015] 取PCV病毒原液，接种于细胞瓶或细胞板的PCV阴性的PK-15细胞，置37°C，5% (?培养箱中吸附10-60min后，弃去接种的病毒液，用PBS对细胞进行1-10次冲洗，将液体 倾倒干净。向洗涂后的细胞瓶或细胞孔中加入裂解液，充分裂解细胞后，将裂解液转移至离 必管中，按试剂盒操作说明书进行病毒DNA的提取。同时，取等量病毒原液进行病毒DNA的 提取。
[0016] 5.相对定量检测
[0017] 按W下体系进行预混，分装置英光定量PCR专用8联管中，然后分别加入标准品质 粒，阴性对照、阳性对照、空白对照、前处理阳样品、病毒原液样品，混匀后立即放入英光定 量PCR仪内。反应条件为95°C3min;95°C30s，56°C6〇3,40个循环，并在561：时采集英光。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明通过在英光定量PCR检测之前加入细胞吸附过 程，从而使英光定量PCR方法可用于检测具有细胞感染能力的PCV病毒粒子，同时通过与病 毒原液中总的病毒粒子数的比较，可W准确得出具有感染力的PCV病毒粒子在总病毒中的 比率，从而可W作为判定种毒有效效价的一个定量方法。本发明既能够准确测定病毒液中 具有感染力的圆环病毒粒子数，又提高了数据的准确性和可重复性，同时极大的缩短了检 测时间。
【附图说明】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中：
[0020] 图1本发明所使用的引物常规PCR扩增结果在电泳检测的图谱，其中；Μ为 DL2000markDNA，1 为PCV-Full-F/PCV-Full-R引物扩增产物。
[0021] 图2为不同稀释度标准品扩增曲线。-1到-9号曲线分别代表PCV2标准品 浓度为 9. 83Xl〇Scopy/ul、9. 83Xl〇7copy/ul、9. 83Xl〇6copy/ul、9. 83Xl〇5copy/ul、 9. 83Xl〇4copy/ul、9. 83Xl〇3copy/ul、9. 83Xl〇2copy/ul、9. 83Xl〇icopy/ul。
[0022] 图3为英光定量标准曲线
[0023] 图4为英光定量检测样品扩增曲线.1到5号曲线分别为阳性对照、病毒原液样 品、细胞吸附处理样品、阴性对照和空白对照。
【具体实施方式】：
[0024] 下面结合附图和具体实例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。
[0025] 1.试验材料
[0026] 1. 1主要试验仪器
[0027] 伯乐C-1000PCR仪、伯乐CFX96英光定量PCR仪、超低温冰箱、紫外分光光度计、高 速离必机、生物安全柜、电泳仪、化学发光凝胶成像系统
[0028] 1. 2试验材料
[0029] 病毒DNA/RNA磁珠法提取试剂盒购自成都拓洋科技有限公司；英光定量PCR检测 试剂2XSsoFastTMP;robesSupe;rmix购自美国伯乐公司；DNA分子量标准、琼脂糖购自宝生 物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。圆环病毒疫苗株由四川华派生物技 术公司提供。引物和探针送上海基康生物科技有限公司合成，见下表。
[00301
[0031] 2实验方法和结果
[0032] 2. 1标准品质粒的构建
[0033] 病毒DNA提取采用成都拓洋科技有限公司的病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒按操作 说明书进行操作。病毒DNA溶于100μ1灭菌蒸傭水中，立即使用或-2(TC。W圆环病毒DNA 为模板，加入引物，通过聚合酶链式反应（PCR)扩增，扩增片段大小约为1774bp(图1)。将 扩增完毕的PCR产物电泳回收后，克隆进PMD19-T载体中（大连宝生物），送上海英俊生物 科技有限公司测序，确认克隆片段为圆环病毒目的基因片段。使用微量紫外分光光度计测 定出质粒的浓度，并经过计算，确定其拷贝数。将确定拷贝数的质粒浓度液进行10倍体积 的梯度稀释，从101倍稀释至109倍，置于-2(TC低温保存。
[0034] 2. 2英光定量PCR条件的优化
[0035]W圆环病毒疫苗的病毒DNA为模板，对退火温度、引物浓度进行优化，确定PCR反 应的最佳条件。经优化后确定最佳反应体系为；25μ1体系，SsoFastProbesSupermix 12. 5μL，模板2μL，上下游引物各0. 5μL，探针0. 5μL，其余用灭菌蒸傭水补足25μL。最 佳退火温度为56°C。反应条件为95°C3min;95°C30s，56°C60s，40个循环，并在56°C时采 集英光，绘制出标准品的扩增曲线（图2)和标准曲线图（图3)。
[0036] 3. 3具有感染病毒粒子的检测
[0037] 取病毒原液200μ1，接种于约70%融合生长于T-25细胞瓶或六孔板的PCV阴性 的ΡΚ-15细胞，置37°C，5%C〇2培养箱中吸附30min后，弃去接种的病毒液，用PBS对细胞 进行冲洗，弃去洗液，3~5次，将液体倾倒干净。向洗涂后的细胞瓶或细胞孔中加入1ml病 毒核酸提取试剂盒裂解液，充分裂解细胞后，将裂解液转移至1. 5ml离必管中，按试剂盒操 作说明书进行病毒DNA的提取。同时，取200μ1病毒原液进行病毒DNA的提取。按最优体 系进行预混，分装置英光定量PCR专用8联管中，然后分别加入阴性对照、阳性对照、空白对 照、细胞吸附处理样品、病毒原液样品，混匀后立即放入Bio-Rad公司的CFX-96型英光定量 PCR仪内。反应条件为95°C3min;95°C30s，56°C6〇3,40个循环，并在561：时采集英光，绘 制出样品检测扩增曲线（图4)。同时与标准曲线进行比较，计算出样品的拷贝数。
【主权项】
1. 一种快速检测具有细胞感染力的圆环病毒含量的方法，包括实时荧光PCR检测猪圆 环病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备、样品细胞吸附前处理、含量测定，其具体特征 如下： (1) 、病毒标准质粒构建及检测标准曲线建立 采用特异性引物，通过PCR扩增，获得圆环病毒全基因片段，将目的片段连接到克隆载 体上，转化到感受态细胞，提取质粒DNA，获得圆环病毒检测用的标准质粒。将制备的标准质 粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光型号，绘制出实施荧光 定量标准曲线，并获得其产物Tm值。 (2) 、细胞吸附 取一定量的待检病毒与敏感细胞进行充分吸附，用缓冲液对细胞进行清洗，将未吸附 上的病毒粒子从细胞上充分洗脱。 (3) 、具有细胞感染力病毒粒子含量的测定 将病毒原液和吸附了病毒的细胞进行核酸提取，通过实时荧光PCR对吸附进细胞中的 病毒的进行检测，通过标准曲线进行相对定量。2. 根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于：引物PCV-Full-F和PCV-Full-R， 能够特异性扩增圆环病毒2型的基因组DNA，扩增产物大小为1774bp。3. 根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：引物T-F、T-R和探针 T-P，能够特异性检测PCV的核酸。4. 根据权利要求1所述的具有细胞感染力病毒粒子含量快速检测方法，其特征在于： 步骤B中，所述的吸附时间为10分钟至12小时，缓冲液可以是生理盐水、磷酸缓冲溶液 (PBS)、hanks、D-Hanks、Earle、MEM、DMEM中的一种或多种，细胞清洗次数为1至10次。5. 根据权利要求1所述的具有细胞感染力病毒粒子含量快速检测方法，其特征在于： 通过检测病毒原液中总病毒和吸附病毒后的细胞中病毒的含量，可以获得病毒原液中具有 感染力病毒粒子与总病毒粒子含量的比值。
【专利摘要】本发明涉及一种快速、定量检测圆环病毒中具有细胞感染力病毒粒子含量的方法，属病毒检测技术领域。该方法包括圆环病毒标准质粒构建及检测标准曲线建立，待测病毒与对照病毒在相同条件下感染靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的病毒基因组，通过荧光定量PCR检测获得待测病毒与对照病毒的相对含量。本方法通过在荧光定量PCR检测步骤之前加入了细胞吸附过程，实现了对有细胞感染力的圆环病毒含量的快速测定。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105331737
【申请号】CN201410385128
【发明人】林华, 陈世界, 杨苗, 肖艳, 严玉宝, 胡娟, 赵姗, 薛昌华
【申请人】四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 成都大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年8月7日