含有粒子的细胞聚集体的制作方法

专利名称：含有粒子的细胞聚集体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于提高细胞的存活率与生物机能的含有粒子的细胞聚集体及其培养方法。
背景技术：
随着干细胞生物医学研究的进步，关于细胞的分化、其生物机能表现的基础知识在不断累积。而且，从各种生物体组织采集成体(组织)干细胞，并与胚胎干(ES)细胞、iPS 细胞一起，这些细胞的研究、药物开发以及应用于治疗成为可能。这样的发展不仅促进对干细胞的增殖、分化、其生物机能的生物医学上的理解，还能通过人为地控制细胞的分化、生物机能，来实现细胞组织化，对与通过人类细胞的利用来进行药物开发研究和提高细胞移植治疗的效果，有着很大帮助。一般来说，已知在体内，细胞几乎不单独存在，通过细胞之间或与细胞外基质的相互作用而生存来发挥其生物机能。因此，如果能够人为地进行细胞的自聚集化或组织化， 与细胞机能相关的生物医学研究就会发展，由细胞移植带来的治疗效果就会提高。体内最小单位是细胞，但作为生物机能的单位，如果观察生物体组织、脏器就可知是细胞的聚集体 (藤田尚男藤田恒夫著，标准组织学各论，医学书院，1992)。到目前为止，已经报告了通过肝细胞的自聚集化来形成细胞聚集体(聚集体)，与没有细胞-细胞相互作用的单独肝细胞相比，肝机能显著提高(Landry J等，J Cell Biol，1985)。与细胞的单独培养相比，通过聚集化细胞的培养，由细胞中产生的纤连蛋白显著增加(Glimeliu S B等，APMIS，1988)，此外，已知ES细胞也同样，通过形成作为其聚集体的类胚体(EB)而促进分化(Smith AG等， Nature，1988)。根据这样的背景，细胞的自聚集化，从细胞生物学和细胞移植的观点来看是重要的技术。至今为止，已知通过培养基材(MoriR 等，J BioSci Bio Eng, 106 (3),237-242, 2008)、培养方法(KuroSawa H, J BioSci BioEng, 104 (4)，四4_299，2007)的努力来促进细胞的自聚集化，如预测那样，基于聚集化能提高细胞的增殖、分化、生物机能的表现。但是， 随着细胞的增殖，细胞聚集体的尺寸变大，其结果导致向细胞聚集体内部的营养、氧的供给以及从聚集体内部除去废物变得不充分，不能继续培养的问题。因此，不能进行对于基于细胞相互作用的细胞机能的表现、分化、组织化等研究所不可缺少的长期培养，妨碍了干细胞的生物医学研究的进展。而且，正在进行通过对细胞进行基因操作并将其在微载体粒子上培养，促进生理活性蛋白质等有用产物的产生的微载体培养。但是，微载体培养法中，细胞仅能在微载体表面增殖，能够增殖的细胞数存在极限。由此，会有有用物质的产生效率低的问题。为此，近年来研究了作为解决该问题的方法之一的使用细胞聚集体的培养法。该方法与微载体法相比，能够提高细胞数，也能提高重要的有用物质的产生能力(Nam J.H.，等 Biotech Prog. 23 (3). 652-6602007)。但是，这种情况下，也会有在细胞聚集体的尺寸增大的同时，聚集体内部的细胞变弱，有用物质的产生能力降低的问题。体外的细胞聚集化技以及将该技术在2类细胞中应用而促进细胞组织化的技术，是现在的发生学、细胞生物学的目标之一的将来的方向。细胞聚集化是其中之一的关键技术。根据这样的背景，希望开发即使增加细胞的聚集体尺寸，也能继续进行培养的努力、方法。现有技术文献非专利文献非专利文献l:Mori R 等，J BioSci BioEng, 106 (3)，237-242，2008非专利文献2:KuroSawa H, J BioSci BioEng, 104 (4)，294-299，2007非专利文献3:Nam J. H.等，BiotEch Prog. 23 (3) · 652-660. 200
发明内容
本发明的目的是提供一种能够长时间稳定地继续培养的细胞聚集体的制作方法以及用于该方法的材料。本发明人为了解决该问题而锐意研究，结果发现如果与生物体吸收性粒子一起培养细胞则能得到含有粒子的细胞聚集体。根据本发明制作的含有粒子的细胞聚集体中，细胞聚集体的内部与外部之间的物质扩散、交换变得容易，由此使得聚集化细胞的长期培养成为可能，能够提高细胞机能并促进分化。通过该技术，使用细胞聚集体的细胞的生物医学研究、通过研究细胞中的药的代谢、毒性的药物开发研究得到进展。此外，可以期待使用细胞聚集体的有用物质的产生能力的提高。此外，即使对于为了免疫隔离目的而将肝、胰、肾细胞等具有机能的细胞用水凝胶制成胶囊来使用的杂化人工脏器，也可以适用利用了该粒子的细胞聚集体技术。这种情况下，胶囊化会限制向内部的细胞的营养、酶的扩散供给，且废物的扩散除去变差，使细胞的环境恶化。为了解决该问题，制作由这些细胞与粒子构成的细胞聚集体，对提高其细胞机能是有效的。由此能够提高治疗效果。S卩，本发明提供由培养细胞与明胶水凝胶粒子构成的含有粒子的细胞聚集体。本发明的一个优选方式中，明胶水凝胶粒子含有细胞增殖因子。此外，本发明的特征在于在含有明胶水凝胶粒子的培养液中培养细胞，提供含有粒子的细胞聚集体的制造方法。在含有粒子的细胞聚集体中，通过粒子的存在来提高向细胞聚集体内部的营养、 氧的供给效率以及从细胞聚集体内部除去废物的效率，使得细胞状态变好。作为其结果，细胞-细胞间的相互作用在与体内状态接近的形态下以良好效率地进行，认为能够实现细胞的长期培养。十分期待通过长期培养来开展更加深入的细胞分化、机能发现的研究。本说明书包括作为本申请优先权的日本专利申请2009-260192号、日本专利申请 2010-050399号的说明书和/或附图中所记载的内容。


图1显示单独培养细胞或者与明胶水凝胶粒子一起培养细胞时的活细胞数。图2显示改变细胞数与粒子数之比来形成细胞聚集体时的含有粒子的聚集体中的活细胞数。图3显示BrdU向含有粒子的细胞聚集体的渗入(取>9込 )。BrdU的免疫染色 (左)，由苏木素对同一切片的对比染色(右)。图4显示含有粒子的细胞聚集体和不含有粒子的细胞聚集体的硫酸化糖胺多糖(glyocosaminoglucan, sGAG)的产生。■含有粒子的细胞聚集体；□不含粒子的细胞聚集体。图5显示含有粒子的细胞聚集体的截面的核染色图像。图6显示改变接种细胞数/添加粒子数的比率进行培养时的细胞聚集体中的活细胞数。*，p< 0.05;相对于不含有微粒的凝集体有显著差。#，p<0.05;相对于添加微粒数1 X IO2的凝集体有显著差。*，ρ < 0. 05 ；相对于添加微粒数1 X IO3的凝集体有显著差。图7显示改变粒子尺寸进行培养时的细胞聚集体中的活细胞数。*，p < 0. 05 ；相
对于不含有微粒的凝集体有显著差。+，P <0.05;相对于溶胀粒子径17. 67士7. 4μπι的凝
集体有显著差。\ P <0.05;相对于溶胀粒子径47. 9 士 22. 2μπι的凝集体有显著差。图8显示含有粒子的细胞聚集体的葡萄糖消耗量。*，ρ < 0. 05 ；相对于不含有微粒的凝集体有显著差。t, P <0.05;相对于溶胀粒子径17. 67士7. 4μπι的凝集体有显著
差。 , ρ < 0. 05 ；相对于溶胀粒子径47. 9士22. 2 μ m的凝集体有显著差。图9显示含有粒子的细胞聚集体的L-乳酸生产量/葡萄糖消耗量的比。*，p < 0. 05 ；相对于不含有微粒的凝集体有显著差。
具体实施例方式本发明中所使用的明胶水凝胶粒子是使用各种化学交联剂在明胶分子间形成化学交联而得到的微粒状明胶水凝胶。明胶可以通过将取自动物、植物的胶原蛋白通过碱水解、酸水解以及酶分解等各种处理来改性来得到。也可以使用作为基因重组型胶原蛋白的改性体的明胶。与水凝胶粒子的交联度和尺寸无关，由于水凝胶内大量含有水，水溶性的营养物、 酶、废物等容易扩散移动。本发明中能够利用的粒子，只要具有上述水凝胶的性质，就可以利用由各种材料构成的粒子。例如是由对聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、 聚乙烯醇等水溶性合成高分子、多糖、蛋白质等进行化学交联后的水凝胶构成的粒子。作为多糖，例举透明质酸、硫酸软骨素等糖胺多糖、淀粉、糖原、琼脂糖、果胶、纤维素等，但不限于这些。此外，作为蛋白质，例举胶原蛋白及作为其水解物的明胶、蛋白多糖、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、Von Wllebrand因子、骨桥蛋白、 血纤蛋白原等，但不限于这些。优选将由被细胞分解的材料构成的粒子适用于本发明，更优选由明胶构成的粒子。为了提高细胞的培养、增殖，可以进一步使用在粒子表面涂敷或固定有胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、糖胺多糖等细胞粘附性蛋白质以及多肽等的粒子。作为化学交联剂，可以使用在EDC等水溶性碳二亚胺、环氧丙烷、双环氧化合物、 羟基、羧基、氨基、巯基、咪唑基等之间形成化学键的缩合剂。优选戊二醛。此外，明胶也可以通过热处理、紫外线照射、电子束照射等进行化学交联。此外，也可以将这些交联处理组合使用。明胶的交联度可以对应于所希望的含水率，即水凝胶的生物体吸收性的水平来适宜选择。在调制明胶水凝胶时的明胶与交联剂的浓度的优选范围是明胶浓度为广20w/ %、交联剂浓度为0. 0riw/w%o对交联反应条件没有特别限定，例如可以在(T40°C、Γ48小时内进行。一般地，如果明胶和交联剂的浓度、交联时间增大，则水凝胶的交联度增加，明胶水凝胶的生物体吸收性降低。或者，可以在减压下高温中进行热脱水交联。热脱水交联可以在例如0. ITorr程度的减压下，在8(Tl60°C，优选12(Tl40°C下进行广48小时。明胶水凝胶粒子例如可以通过如下过程来制作在三孔圆底烧瓶上安装固定的搅拌用电机(例如、新东科学公司制、三一式电机(^一夕一 )、EYELA miniD. C.搅拌器等)和特氟隆(注册商标)用螺旋桨叶，在与烧瓶一起固定的装置中注入明胶溶液，其中加入橄榄油等油，以20(T600rpm程度的速度搅拌，形成W/0型乳化液，向其中添加交联剂水溶液，在明胶分子间形成交联。或者，也可以预先将明胶水溶液在橄榄油中预乳化(例如使用漩涡混合器(Vortex mixer)Advantec TME-21、勻浆器、polytron PT1(K35 等)，将其滴加在橄榄油中来调制微粒化的W/0型乳化液，在其中添加交联剂水溶液来进行交联反应。如此制得的明胶水凝胶粒子通过离心分离回收后，由丙酮、酢酸乙酯等洗净，进一步在2-丙醇、乙醇等中浸渍，停止交联反应。所得的明胶水凝胶粒子依次由2-丙醇、含有TweenSO的蒸馏水、蒸馏水等洗净后，用于细胞培养。在明胶水凝胶粒子发生凝集的情况下，也可以添加表面活性剂等或进行超声波处理(优选在冷却下1分钟以内的程度)等。所得的明胶水凝胶粒子的平均粒径随着上述粒子制作时的明胶浓度、明胶水溶液与橄榄油的体积比以及搅拌速度等变化。通常，粒径为500ηπΓ 000μπι，根据目的，可以对适合需要的尺寸的粒子进行粗分来使用。此外，本说明书中，有时将“粒径”表示为“粒子尺寸”。“粒径”与“粒子尺寸”可相互互换使用。进而，通过预乳化，可以得到粒子尺寸为 50nm-20 μ m以下的微粒状的明胶水凝胶粒子。进而，通过使明胶从水溶液状态发生相分离、 自聚集，可以得到50nm-l μ m的尺寸的粒子。相分离可以通过添加第2成分、改变水溶液的 PH、离子强度等公知技术来实现。本发明中优选的粒子尺寸为约50nm-1000 μ m，特别优选为约500nm-1000 μ m,更优选为约1 μ m_200 μ m,进而优选为约10 μ m 160 μ m。作为调制明胶水凝胶粒子的其它方法，还可例举以下的方法。在与上述方法同样的装置中装入橄榄油，以20(T600rpm程度的速度搅拌，向其中滴加明胶水溶液，调制W/0型乳化液，将其冷却后，加入丙酮、酢酸乙酯等，搅拌，通过离心分离回收未交联的明胶粒子。 将回收的明胶粒子进一步由丙酮、酢酸乙酯等以及随后的2-丙醇、乙醇等洗净后，干燥。该阶段中，根据目的，可以对适合所需尺寸的粒子进行粗分。可以使该干燥明胶粒子混悬在含有0. l%Tween80的交联剂水溶液中，缓慢搅拌的同时进行交联反应，根据所使用的交联剂， 在含有0. l%Tween80的IOOmM甘氨酸水溶液或者含有0. l%Tween80的0. 004N HCl等中洗净，停止交联反应，由此来调制明胶水凝胶粒子。由本法所得的明胶水凝胶粒子的平均粒径与上述方法时同样。本发明的明胶水凝胶粒子可以冷冻干燥、灭菌来使用。冷冻干燥可以通过例如将明胶水凝胶粒子加入到蒸馏水中，在液氮中冷冻30分钟以上或者在-80°C冷冻1小时以上后，在冷冻干燥机中干燥广3天来进行。本发明的粒子细胞聚集体，可以通过将细胞与如上所述制作的明胶水凝胶粒子等水凝胶粒子一起，在通常的细胞培养用培养基中进行培养来形成。作为本发明中所使用的细胞，只要是通常的培养细胞，就可以使用各样的细胞，可以是细胞株，也可以是初代培养细胞。能按本发明方法培养的细胞的特别优选的例子是干细胞，例如骨髓未分化间叶干细
6胞、造血干细胞、血管干细胞、神经干细胞、小肠干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞、齿周组织干细胞、纤毛(毛様体)干细胞、角膜轮部干细胞、内脏干细胞等的组织干细胞、ES细胞、iPS 细胞等多能性干细胞。培养基的组成物、培养温度等培养条件可以采用通常的这些细胞的培养中所使用的条件。需要说明的是，按本发明培养粒子细胞聚集体时，为了防止细胞与培养皿的表面粘附而增殖，优选使用由聚乙烯醇等进行了涂敷的培养皿或者具有低蛋白质吸附性质或低细胞附着性质的基材来进行培养。粒子数与细胞数的比率，虽随着粒子直径、细胞性质而不同，但一般地，粒子数/细胞数例如为0. 1至30，优选为0. 3至10，更优选为0. 5 至5，但不限于上述范围。本发明中的粒子细胞聚集体，通过一边适当地更换培养基一边进行培养，可以在7 天到40天或者这以上的时间进行培养。如后述的实施例所示，就本发明的粒子细胞聚集体而言，不仅在聚集体表面而且在内部，存在的细胞也能生存、增殖。粒子细胞聚集体能够从直径50 μ m增殖到3000 μ m的尺寸，有时能够成长到5000 μ m程度的大小。虽然随着细胞种类和培养方法而不同，但在观日的培养下能够实现1500 μ m直径的聚集体的形成。这被认为是因为通过在细胞聚集体中存在粒子，聚集体内外的物质扩散提高，改善了向细胞的营养、氧的供给以及废物的排泄。根据粒子的尺寸，细胞聚集体与粒子的混合样式而不同。ΙΟΟμπι以上的粒子的情况下，首先细胞在粒子表面增殖。如果继续培养，在粒子之间形成细胞聚集体。在20-100 μ m 尺寸的粒子的情况下，初期时在粒子间形成细胞聚集体，随着时间会发现细胞聚集体渗入粒子的现象。粒子尺寸如果为5-20 μ m，自培养初期会形成含有粒子的细胞聚集体。这样的各种粒子尺寸时虽都形成细胞聚集体，但其过程不同，因此，可以根据细胞聚集体的最终使用目的来区分使用粒子尺寸。在本发明的一个优选方式中，在使细胞增殖因子渗入如上所述所得的明胶水凝胶粒子等水凝胶粒子中后，可以将细胞与该粒子一起培养。作为细胞增殖因子，只要是具有促进细胞增殖、分化作用的蛋白质即可使用，可以例举例如碱性成纤维细胞增殖因子 (bFGF)、酸性成纤维细胞增殖因子(aFGF)、血小板来源增殖因子(PDGF)、转化增殖因子β 1 (TGF-β 1)、血管内皮细胞增殖因子(VEGF)以及结缔组织增殖因子(CTGF)、或具有抑制细胞凋亡性质的蛋白质和具有上述性质的多肽等。通过使用含有细胞增殖因子的明胶水凝胶粒子等水凝胶粒子，能够促进细胞的增殖、分化。除了细胞增殖因子以外，也可以在粒子中含有具有促进细胞增殖、分化或提高代谢活性、抑制细胞凋亡等作用的药物(低分子量药物、多肽药物、核酸药物等)来使用。通过以下实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。实施例1在固定的搅拌用电机(新东科学公司制，三一式电机)上安装特氟隆(注册商标) 制搅拌用螺旋桨叶，与IOOOml圆底烧瓶一起固定。在烧瓶中加入橄榄油375ml，在37°C、 420rpm下一边搅拌一边滴加等电点4. 9的碱处理明胶水溶液(浓度约10%) 10ml，调制W/0 型乳化液。10分钟搅拌后，将烧瓶冷却到4°C，搅拌30分钟。冷却后，在其中加入IOOml丙酮，搅拌1小时，通过离心分离回收明胶水凝胶粒子。将回收的水凝胶粒子用丙酮洗净，进一步用2-丙醇洗净，得到未交联的明胶水凝胶粒子。将该水凝胶粒子干燥，在4°C保存。使500mg干燥后的未交联明胶水凝胶粒子混悬于含有0. l%Tween80的戊二醛(0. 05%)水溶液IOOml中，通过在4°CJ4小时的缓慢搅拌，进行明胶的交联反应。反应结束后，通过离心分离回收交联明胶水凝胶粒子，通过用IOOmM甘氨酸水溶液在37°C洗净1 小时而停止交联反应。反应停止后，用蒸馏水洗净交联明胶水凝胶粒子3次后，进行冷冻干燥，得到干燥交联明胶水凝胶粒子(平均直径10 μ m)。用水使该粒子溶胀时，含水率为约 91. 5% ο按照常法从大鼠骨髓分离骨髓来源未分化间叶干细胞(MSC)，进行培养来增殖。然后，将MSC与明胶水凝胶粒子以各种比率混合，在37°C培养14天。在D-MEM培养基上使用含有胎牛血清IOvoW)的培养液进行细胞培养，每隔3日更换培养基。此时，为了降低细胞粘附性，使用将1%聚乙烯醇(尤尼吉可(株)公司制、聚合度1.800，碱化度88. 0%)水溶液注入培养皿，在37°C放置15分钟，用磷酸缓冲溶液(PBS、pH7. 4)洗净2次并涂敷聚乙烯醇的培养皿。通过使用该培养皿，使得MSC不与皿表面粘附，促进在混合后的粒子上或细胞之间的粘附。其结果，形成含有均勻粒子的MSC聚集体。作为对照，在没有粒子的情况下，发现形成不含有粒子的细胞聚集体。使用WST-8试剂定量活细胞数，算出相对于接种细胞数的比。含有粒子的MSC聚集体与没有放入粒子的细胞聚集体相比，活细胞数显著提高，促进了细胞增殖(图1)。在没有放入粒子的情况下，虽然初期形成了细胞聚集体，但聚集体尺寸不随着时间而增大，认为是由于营养和酶的供给不足、废物的排泄差而导致细胞死亡。实施例2改变MSC与粒子数之比，同样地进行细胞聚集体的制作。其结果，粒子数/细胞数为0. 3以上时，活细胞数随着培养时间而提高(图2)。即，随着粒子/细胞比增大，细胞存活率增加。该结果可以认为是因为通过在细胞聚集体中存在粒子，提高了聚集体内外的物质扩散，改善了细胞的营养、氧的供给以及废物的排泄。实施例3与实施例2同样，制作粒子数/细胞数比为0. 5的含有粒子的MSC聚集体，研究 BrdU向聚集体中的渗入。在细胞培养第6天，在培养基中添加BrdU，在第7天回收细胞聚集体，制作冷冻切片。对通过聚集体中心的最大面积切片使用抗BrdU抗体来免疫染色。被染色的部位表示BrdU向核的渗入高，细胞在增殖。其结果确认了 BrdU向聚集体表面和内部的细胞的渗入，表明在内部存在的细胞也在增殖(图3)。与此相对，使用不含有粒子的MSC 聚集体在相同条件下进行培养，形成细胞聚集体，研究BruU的渗入，虽然在聚集体表面附近的细胞中确认了渗入，但在内部细胞中完全没有发现渗入，表明内部细胞死亡。实施例4在与实施例3相同条件下，形成含有粒子的MSC聚集体。然后，通过将其在次软骨分化培养基(含有lwt%转铁蛋白和胰岛素、ImM丙酮酸、IOOmM抗坏血酸_2_磷酸、IOOnM地塞米松、lOng/ml转化增殖因子(TGF) β 1的高葡萄糖DMEM培养基，含有1%FCS)中培养，诱发软骨分化。作为对照，使用不含有粒子的MSC聚集体。由硫酸化糖胺多糖(sGAG)的分泌量来评价软骨分化。sGAG的测定如下进行。将细胞在300 μ g/ml浓度的木瓜蛋白酶溶液 (含有2mM 二硫苏糖醇和ImM EDTA，pH6. 5磷酸水溶液)中溶解。在该细胞溶解液(25 μ L) 中加入1，9-二甲基亚甲基蓝(225 μ L)，测定525nm的吸光度。使用硫酸软骨素来制作标准曲线，由此对sGAG进行定量。其结果在含有粒子的MSC聚集体中，sGAG的分泌在整个观日内都检出。另一方面，不含有粒子的聚集体中，完全没有确认到sGAG的分泌。这样的结果显示在含有粒子的细胞聚集体中，效率良好地引发软骨分化(图4)。这被认为是，即使在聚集体内部，物质扩散，保持良好的细胞生存状态。实施例5在实施例1中制造的明胶水凝胶粒子干燥物中，滴加TGF- β 1水溶液，在25V放置1小时，由此使其含浸在明胶水凝胶粒子内。在与细胞混合培养的明胶水凝胶粒子中含浸的TGF-β 1量为lng。使用该粒子来形成MSC聚集体，与实施例4同样地诱发软骨分化，通过sGAG分泌来研究软骨分化。其结果，在含有TGF-β 1含浸的粒子的情况下，确认了软骨分化，sGAG分泌量显著增加。该分泌量显示比实施例4的含有粒子的细胞聚集体更高的值。作为对照，在不含有粒子的细胞聚集体的培养液中加入同量(Ing)的TGF-β 1来进行实验，这种情况下，没有发现软骨分化。含有TGF-β 1含浸的粒子的MSC聚集体的软骨分化培养后，用阿尔新蓝对细胞聚集体染色。其结果，确认了在聚集体内部均勻地被阿尔新蓝染色的软骨基质的存在。另一方面，在不含有粒子的聚集体中，细胞死亡。这样的结果显示，通过粒子的存在，细胞聚集体内部与外部之间的物质扩散性提高，细胞的状态变好，同时，来自粒子的TGF-β 1的局部供给进一步促进软骨分化。实施例6与实施例1同样地制作明胶水凝胶粒子。只是，在粒子制作中采用热脱水交联(140°C、48小时、0. ITorr的条件)。水溶胀时的粒子尺寸为17. 6 μ m士7. 4 μ m (干燥时粒子尺寸10 μ m)。使MSC数为IX IO4细胞/孔、粒子数为1 X IO4个/孔，与实施例1同样地培养，培养7天后进行观察。制作含有粒子的细胞聚集体的冷冻切片，对细胞核进行染色(细胞核染色用T0-PR0-3荧光色素，^witrogen公司制)。之后，由共焦点荧光显微镜和光学显微镜观察切片。图5显示细胞聚集体的截面的核染色图像(A)共焦点荧光显微镜图像(染红细胞核)、(B)光学显微镜、(C)聚合)。其结果表明，即使在聚集体内部，活的细胞以及细胞与粒子混合均勻。实施例7除交联方法以外，与实施例1同样的方法来制作明胶水凝胶粒子，只是粒子制作时的搅拌数改变为200、300和450rpm。用丙酮、2-丙醇洗净，干燥后，分别筛分各干燥粒子，得到干燥时平均粒子径为10口111、26口111禾口44口111的3种未交联粒子。将其在140°C、48小时、0. ITorr的减压下进行热脱水交联，使明胶交联，调制明胶水凝胶粒子。所得的粒子用蒸馏水溶胀时，粒子径为 17. 6士7. 4μπι、47. 9士22. 2 μ m和 106. 8士 17. 8 μ m，含水率为 92. 0%。使用这样的3种尺寸不同的明胶水凝胶粒子，与实施例1同样地与MSC —起培养，制作含有粒子的MSC聚集体。图6显示使用粒子尺寸106 μ m的粒子、接种细胞数为1 X IO3细胞/孔、添加粒子数为1 X IO2个/孔、1 X IO3个/孔或者1 X IO4个/孔进行培养时的活细胞数。作为对照，将不含有粒子的聚集体(无粒子)使用通常培养基材进行2维平板培养(平面培养)。其结果表明，不含有粒子的细胞聚集体中，细胞没有增殖，而是死亡。与此相比，含有粒子的细胞聚集体中，发现细胞的增殖，可知通过选择MSC/粒子比，比平板培养更好地增殖。图7显示改变所使用的粒子尺寸，在接种细胞数为1 X IO3细胞/孔、添加粒子数为IX IO4个/孔时进行培养时的活细胞数。作为对照，将不含有粒子的聚集体(无粒子)使用通常培养基材进行2维平板培养(平面培养)。其结果为，与粒子尺寸无关，在各种情况下，与不含有粒子的细胞聚集体相比，细胞的增殖显著增大。另外，粒子尺寸为106μπι(干燥时尺寸44 μ m)时，与平板培养相比，发现显著高的细胞增殖。实施例8以与实施例7同样的方法进行培养实验。作为培养中的细胞状态的指标，选择葡萄糖消耗量，使用Glutest Neo Super (爱科来(株)制)来定量细胞的葡萄糖消耗量。细胞数为1 X IO4个/孔时粒子数为1 X IO4个/孔，所使用的粒子尺寸为17. 6,47.9和106. 8 μ m(干燥时的粒子尺寸为10 J6和44 μ m)。其结果如图8所示。各种情况下，随着培养的进行而消耗葡萄糖，表明细胞在成长。与所用的粒子的尺寸无关，与不含有粒子的细胞聚集体相比，含有粒子的细胞聚集体的葡萄糖消耗量显示显著的高值。此外，粒子尺寸为106 μ m时，为最高消耗量，这与平板培养相比显著高，表明细胞的成长状态良好。实施例9以与实施例7同样的方法进行培养实验。作为细胞的能量代谢的指标，算出L-乳酸生产量/葡萄糖消耗量比。如果该指标低，则表明细胞中进行好氧能量代谢，意味着细胞的氧状态良好。L-乳酸产生采用E-试剂盒(R-Biopharm AG公司制)来定量。细胞数为1 X IO3个/孔，粒子数为1 X IO4个/孔，使用的粒子尺寸为17. 6,47.9和106. 8ym (干燥时尺寸10,26和44 μ m)。其结果如图9所示。于所使用的粒子的尺寸无关，含有粒子的细胞聚集体的L-乳酸产生量/葡萄糖消耗量之比与不含有粒子的细胞聚集体相比显著降低。进而，其值与平板培养处于相同水平。这表明，通过含有粒子，在细胞聚集体内部的氧状态变得良好，其结果显示细胞的好氧能量代谢高。其值对于氧、营养状态而言，与据认为比3维细胞聚集体更优良的平板培养相比是同等水平。含有106 μ m尺寸的粒子的细胞聚集体的直径为500 μ m(培养4天后)、600 μ m (培养7天后)。已知通常通过扩散来供给氧的距离是100 μ m,因此，如果细胞聚集体尺寸大于100 μ m，则细胞聚集体内部处于缺氧状态，细胞会死亡。但是，通过含有粒子来形成细胞聚集体，在聚集体内部可以形成能够效率良好地供给营养、氧的环境，即使在具有500和600 μ m这样大尺寸的细胞聚集体内部，细胞也不死亡，能够进行良好的代谢。本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请，在此直接作为参考引入到本说明书中。
权利要求
1.一种含有粒子的细胞聚集体，由水凝胶粒子与细胞构成，所述水凝胶粒子是通过在从水溶性合成高分子、多糖和蛋白质组成的组中选择的一种或多种水溶性合成高分子中形成化学交联来得到的。
2.如权利要求1所记载的含有粒子的细胞聚集体，水溶性合成高分子选自聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟基乙酯和聚乙烯醇。
3.如权利要求1或2所记载的含有粒子的细胞聚集体，多糖选自糖胺多糖、淀粉、糖原、 琼脂糖、果胶和纤维素。
4.如权利要求广3任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，蛋白质选自胶原蛋白及作为其水解物的明胶、蛋白多糖、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、Von Wllebrand因子、骨桥蛋白和血纤蛋白原。
5.如权利要求1、任一项所记载含有粒子的细胞聚集体，由对明胶形成分子间化学交联而得到的明胶水凝胶粒子与细胞构成。
6.如权利要求广5任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，在所述水凝胶粒子表面涂敷或固定有细胞粘附性蛋白质或细胞粘附性多肽。
7.如权利要求6所记载的含有粒子的细胞聚集体，所述细胞粘附性蛋白质和细胞粘附性多肽选自胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和糖胺多糖。
8.如权利要求广7任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，所述水凝胶粒子的粒径为 50nm-1000 μ m。
9.如权利要求8所记载的含有粒子的细胞聚集体，所述水凝胶粒子的粒径为IOOymW 上、20-100 μ m 或 5-20 μ m 的任一种。
10.如权利要求1、任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，相对于1个所述细胞，所述水凝胶粒子为0. 1-30个。
11.如权利要求广9任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，相对于0.Img所述水凝胶粒子，细胞数为300至3000个的比例。
12.如权利要求广11任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，所述水凝胶粒子含有细胞增殖因子。
13.如权利要求广12任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，所述水凝胶粒子由明胶形成时，明胶与交联剂的浓度范围为明胶浓度为广20w/w%以及交联剂浓度为0. Oriw/W%o
14.如权利要求广13任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体，细胞为干细胞。
15.权利要求广14任一项所记载的含有粒子的细胞聚集体的制造方法，在含有所述水凝胶粒子的培养液中培养细胞。
全文摘要
本发明涉及含有粒子的细胞聚集体及其制造方法，该含有粒子的细胞聚集体由水凝胶粒子和细胞构成，所述水凝胶粒子是通过在从水溶性合成高分子、多糖和蛋白质组成的组中选择的一种或多种水溶性合成高分子中形成化学交联来得到的。
文档编号C12N11/02GK102597230SQ20108005087
公开日2012年7月18日 申请日期2010年11月12日 优先权日2009年11月13日
发明者田畑泰彦 申请人:株式会社日立高新技术