一种快速检测落选短体线虫的环等温扩增引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原物检测技术领域。更具体地，设及一种快速检测落选短体线 虫的环等溫扩增引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 短体线虫，也称为根腐线虫，是一种重要的迁移性内寄生线虫，该类线虫由68个 有效种组成。根腐线虫在植物跟内移动、穿刺和取食会引起根组织形成坏死斑、空腔进而 使根组织坏死。由于根部坏死，所W被根腐线虫危害的植物会表现出缺水和营养不足的症 状。短体线虫是造成经济损失最大的Ξ种植物线虫之一，其中落选短体线虫（Pratylenchus neglec化S)是最重要的短体线虫之一。它们不单分布广泛，而且可W侵染多种重要的农作 物。但是，不同种类作物或不同的品种对落选短体线虫的抗病性和耐病性有差异，因此，轮 作和种植抗病品种是防治运种短体线虫的有效方法。如此一来，只有正确的鉴定运种线虫， 才能在实际工作中选择合适的作物或品种种植来防治它们。
[0003] 但是，目前主要还是通过形态学的方法进行鉴定，而形态学鉴定落选短体线虫和 桑尼短体线虫是一个复杂和耗费大量时间的工作，而且对于大部分人来说运是一个非常困 难的工作，往往也会造成准确性低的问题。此外，形态学的鉴定方法只能准确的鉴定短体线 虫的成熟雌虫，但是在田间调查的时候，常常会分离到大量不同龄期的幼虫。因此，要通过 形态学方法准确的鉴定落选短体线虫幼虫，目前在技术上还是不可能的。
[0004] 目前，国外有报道通过PCR或实时巧光PCR方法检测和定量落选短体线虫的方法， 但是，该方法需要使用昂贵的PCR仪，而且，还需要进行电泳检测，对操作人员的技术要求 较高，不利于在基层检测单位中推广和使用。因此，在实际的应用中，使用环等溫扩增的方 法检测落选短体线虫会大大减轻的基层人员的工作量和检测成本。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有落选短体线虫检测技术的不足，为解决快速 检测落选短体线虫提供一组引物组和检测方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种快速检测落选短体线虫的环等溫扩增引物。
[0007] 本发明另一目的是提供上述环等溫扩增引物的应用。
[0008] 本发明上述目的通过W下技术方案实现：
[0009] 一种快速检测落选短体线虫的环等溫扩增引物，包括外侧引物pnF32/pnB32和内 侧引物pnFIP2/pnBIP2;引物pnF32的序列（如SEQIDNO. 5所示），引物pnB32的序列（如 SEQIDNO. 6所示），引物pnFIP2的序列如（SEQIDNO. 7)所示，引物pnBIP2的序列（如 沈QIDNO. 8所示）。
[0010] 上述环等溫扩增引物在检测落选短体线虫方面的应用或者在制备检测落选短体 线虫的试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
[0011] 一种快速检测落选短体线虫的环等溫扩增方法，该方法是W样品DNA为模板，利 用上述引物对pnF32/pnB32和引物对pnFIP2/pnBIP2进行环介导等溫扩增反应。
[0012] 所述环介导等溫扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出 现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有落选短体线虫DNA，即为落选短体线虫阳性；或者 向扩增产物中加入SYBRgreenI或巧黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定 样品中含有落选短体线虫DNA，即为落选短体线虫阳性。
[0013] 优选地，所述环等溫扩增方法的反应体系为：1μLDNA，引物pnFIP和pnBIP各 1.6μM，引物pnF3和pnB3各0.2μM，dNTP0.35μM，2.5μL10XBST2.0DNA聚合酶缓冲 液，0.8M甜菜碱，1. 5μLΜ拆〇4(lOOmM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶，余量d地2〇补足，共 25μL。
[0014] 优选地，所述环等溫扩增方法的反应条件为：65°C反应60min。
[0015] 一种快速检测落选短体线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对pnF3/pnB3和 引物对pnFIP/pnBIP。
[0016] 所述试剂盒所使用的检测方法即为上述环等溫扩增方法。
[0017] 上述环等溫扩增方法或上述试剂盒在检测落选短体线虫方面的应用也都在本发 明的保护范围之内。 阳01引本发明通过大量的研究和探索，最终得到的引物对pnF32/pnB32和引物对pnFIP2/pnBIP2配合使用，建立的环等溫扩增方法，不仅能够非常特异的检测落选短体线 虫，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度，检测效果非常好。而且环等溫扩 增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，对实验检测人员的要求也很低，是一种安全、简单、 快速、成本低的检测方法。
[0019] 本发明具有W下有益效果：
[0020] 本发明提供了一组快速检测落选短体线虫的环等溫扩增引物。所述引物特异性 强、灵敏度好、且具有很好的重复性。本发明利用所述引物进行环介导等溫扩增反应检测落 选短体线虫，检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度。
[0021] 本发明仅需使用简单的恒溫仪器就能完成全部的检测，不需要依赖于任何昂贵的 仪器，并且检测时间仅为60min，比普通的RT-PCR提前了 2~化，简单快速、对环境要求低、 无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。
[0022] 另外，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可W 实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用漠化乙锭，保障了工作人员 的安全，为落选短体线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广 应用价值。
【附图说明】
[0023] 图1为不同引物的LAMP电泳图对扩增效率的影响。
[0024] 图2为引物组1的LAMP特异性检测结果。图中1~6为不同种群的落选短体线 虫，7~24为非祀标线虫（具体种类见表1)。
[0025] 图3为引物组2的LAMP特异性检测结果。图中1~6为不同种群的落选短体线 虫，7~24为非祀标线虫（具体种类见表1)。
[0026] 图4为引物组3的LAMP特异性检测结果。图中1~6为不同种群的落选短体线 虫，7~24为非祀标线虫（具体种类见表1)。
[0027]图5为不同浓度的线虫DM的可视化检测结果，0. 1、1、10和100表示使用的DM来自于0.1、1、10和100条落选短体线虫，CK表示使用灭菌水作为模板。 W28] 实施例1引物设计
[0029] 1、根据NCBI中多种短体线虫的28s核糖体DNA序列（基因登录号为：EU130854、 JX046968、KM200579、JQ303333、JX261951、JX261960、JX261954、EU130875、EU130866、 EU130873、EU130845、JN244270、EU130889、HQ662581、JN091970、AM231916、JX261948、 KF765435、DQ498832、JX047005、JQ003994、GU214114、JX144360)，设计引物如下：
[0030] (1)引物组1: 阳0川外侧引物pnF31 (如沈QIDNO. 1所示）：
[0032] 5' -ACGGATAGAGCCAGCGTA-3'。 阳〇3引外侧引物pnB31 (如沈QIDNO. 2所示）：
[0034] 5'-TCGGGTTCCAGCAAGCT-3，。 阳0对内侧引物pnFIPl(如沈QIDNO.3所示）：
[0036] 5' -TCCGTCCCAATCTGGAGAGCGGttttttTCGGGCCAGCATTCATCTG-3'
[0037] 内侧引物pnBIPl(如沈QIDNO. 4所示）： 阳的8] 5, -GTTTGTACCCGGCCGAGCGttttttGCAAAAGCAGGTTCACACC-3'
[0039]似引物组2 柳4〇] 外侧引物pnF32 (如沈QIDNO. 5所示）
[0041] 5' -ACGTGAACCGGTGAGGTG-3'
[0042] 外侧引物pnB32 (如沈QIDNO.6所示）
[0043] 5, -TCGGGTTCCAGCAAGCT-3' W44] 内侧引物pnFIP2 (如沈QIDNO. 7所示）：
[0045] 5' -GAGAGCGGAACAAGGGCGCGt