tttttAAACGGATAGAGCCAGCGTA-3,
[0046] 内侧引物pnBIP2(如沈Q ID NO. 8所示）：
[0047] 5, -GTTTGTACCCGGCCGAGCGttttttGCAAAAGCAGGTTCACACC-3'
[0048](3)引物组3 W例外侧引物pnF33 (如沈QIDNO. 9所示） 阳0加]5, -TCATCTGCGAGGTCGGC-3，
[0051] 外侧引物pnB33 (如沈QIDNO. 10所示）
[0052] 5' -GCCATGCCCCAGGGAA-3' 阳化引内侧引物pnFIP3(如沈QIDNO. 11所示）：
[0054] 5, -CACTCACCAACAAATGCACCGCttttttCTCTCCAGATTGGGACGGA-3' 阳化5] 内侧引物pnBIP3 (如沈QIDNO. 12所示）：
[0056] 5, -GACGGCGGTGTGAACCTGCTttttttTGAACCCAGAACGAACAGC-3，
[0057]2、不同引物组的扩增效率
[0058] 按照BST2. 0DNA聚合酶的使用说明进行，环等溫扩增方法的反应体系为：1μL DNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1.6μΜ，引物ptF31 和Ρ巧31 各 0. 2μΜ，dNTP0. 35μΜ， 2. 5μΙ10XBST2.ODNA聚合酶缓冲液，0.8Μ甜菜碱，1.5μΙMgS04(100mM)，lyL BST2.ODNA聚合酶，余量d地20补足，共25μL。环等溫扩增方法的反应条件为：65°C反应 60min〇
[0059] 结果如图1，两组引物都能从落选短体线虫的DM中扩增出特异的条带。 W60] 实施例4LAMP反应的特异性检测
[0061] 1、为验证本发明引物和LAMP反应体系的有效性和特异性，我们同时使用了多个 不同种群的落选短体线虫和其他非祀标的线虫的DNA作为模板进行检测，具体线虫种类如 表1所示。
[0062] 表1实验使用的线虫种群及对应的可视化检测结果
[0063]
[0064]
W65] 2、分别提取表1中各线虫的DM,分别利用引物组1、引物组2、引物组3,按照实施 例2的中所述的LAMP反应条件进行LAMP扩增。
[0066] 3、结果如附图2、附图3、附图4和表1所示，图2(引物组1)中1、2、3、4、7号管发 生了颜色的变化，为阳性；图3中（引物组2)中1、2、3、4、5、6号管发生了颜色的变化，为阳 性；图4中（引物组3)中1、2、3、4、5号管发生了颜色的变化，为阳性。
[0067] 结果表明，本发明所述的LAMP引物组中，引物组1不能检测落选短体线虫种群化5 和化6,而且对来自山东潍坊的桑尼短体线虫有非特异反应；引物组3不能检测落选短体线 虫种群Pn5和Pn6 ;只有引物组2能有效的检测不同种群的落选短体线虫，并且对非祀标线 虫不会有非特异性的扩增，即不能够扩增检测到非祀标线虫，对落选短体线虫的特异性非 常好。 W側同时，本发明所述的LAMP方法能有效的检测到单条的祀标线虫，具有非常好的灵 敏性，能够满足实际的检测和定量工作需要。 W例实施例3LAMP反应的可视化检测及灵敏性检测
[0070] 1、综上所述，本发明建立的快速检测落选短体线虫的环等溫扩增方法如下： 柳71] PCR反应体系为：ΙμΙ DNA，引物pnFIP2/pnBIP2各1.6μΜ，引物pnF32/pnB32 各0. 2μΜ，dNTP 0. 35μΜ，2. 5μΙ 10XBST2. 0DNA聚合酶缓冲液度ST2. 0DNA polymerase buffer)，0. 8M甜菜碱，1. 5 μLΜ拆〇4(100mM)，1 μLBST2. ODNA聚合酶度ST2. ODNA polymerase)，余量d地2〇补足，共25 μL。
[0072] 反应条件：65°C反应60min。
[0073] 2、根据上述反应体系和优化后的反应条件进行LAMP反应，反应结束后，不仅能通 过琼脂糖凝胶电泳进行检测，还能够通过添加SYBRGreenI染料或巧黄绿素进行可视化检 巧。，结果判断方法更灵活、更方便。
[0074] 3、分别W不同浓度的落选短体线虫线虫DNA为模板，W上述反应体系和反应条件 进行LAMP反应，反应结束后，使用2 %琼脂糖凝胶电泳对上述产物进行检测。 阳0巧]同时，在LAMP反应产物中加入ΙμΙ 5000 XSYBR Green I染料（购自ThermoFisher scientific公司，使用前加入灭菌水稀释至5000X的浓度）混匀后观察结 果，阳性产物呈现出由橘红色变为巧光黄或巧光绿色的颜色变化（具体颜色的深浅由产物 的含量决定），说明验证可视化结果的准确。
[0076] 可视化结果如附图4所示，图中，除了CK组，其他均发生了颜色变化，为阳性，电泳 检测与可视化的结果一致，也说明了本发明检测方法结果的稳定性和可靠性。
[0077] 同时上述结果也说明了本发明所述的LAMP反应方法能检测到0. 1条落选短体线 虫的DNA模板，具有非常好的检测灵敏性。
【主权项】
1. 一种快速检测落选短体线虫的环等温扩增引物组，其特征在于，包括外侧引物 pnF32/pnB32和内侧引物pnFIP2/pnBIP2;引物pnF32的序列如SEQIDN0·5所示，引物 pnB32的序列如SEQIDN0·6所示，引物pnFIP2的序列如SEQIDN0·7所示，引物pnBIP2 的序列如SEQIDNO. 8所示。2. 权利要求1所述环等温扩增引物组在检测落选短体线虫方面的应用。3. 权利要求1所述环等温扩增引物组在制备检测落选短体线虫的试剂或试剂盒方面 的应用。4. 一种快速检测落选短体线虫的环等温扩增方法，其特征在于，该方法是以样品DNA 为模板，利用权利要求1所述外侧引物对pnF32/pnB32和内侧引物对pnFIP2/pnBIP2进 行环介导等温扩增反应。5. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应结果 的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有 落选短体线虫DNA，即为落选短体线虫阳性； 或者向扩增产物中加入SYBRgreenI或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿 色，则判定样品中含有落选短体线虫DNA，即为落选短体线虫阳性。6. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应体 系为：1μLDNA，引物pnFIP2 和pnBIP2 各 1. 6μM，引物pnF32 和pnB23 各 0· 2μM，dNTP 0.35μM，2.5yL10X^572.0DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5yLMgS04 (100mM)，l μL仍72. 0DNA聚合酶，余量ddH20补足，共25μL。7. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应条 件为：65°C反应60min。8. -种快速检测落选短体线虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所 述外侧引物对pnF32/pnB32和内侧引物对pnFIP2/pnBIP2。9. 根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所使用的检测方法为权利要 求4所述环等温扩增方法。10. 权利要求4所述环等温扩增方法或权利要求8所述试剂盒在检测落选短体线虫方 面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测落选短体线虫的环等温扩增引物组。所述引物组包括外侧引物对pnF32/pnB32和内侧引物对pnFIP2/pnBIP2，引物的序列分别如SEQ？ID？NO.5～8所示。本发明以该引物组建立了环等温扩增方法，以样品DNA为模板进行环等温扩增，反应结束后可通过两种方式判断结果：一是扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；二是通过向反应体系中加入SYBR？green？I，通过肉眼观察出现颜色变化的样品为阳性。该环等温扩增方法对仪器设备要求低、快速、安全、特异性好、敏感性强，为落选短体线虫的检测，尤其是基层检疫单位对落选短体线虫的快速检测工作提供了技术支持，具有很好的推广应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105331736
【申请号】CN201510940146
【发明人】林康艺
【申请人】林康艺
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月15日