TG-3' 1)引物及探针的浓度优化：将外引物：内引物：环引物分别按照1:1:1、1:2:1、 1 : 2 : 2、1 : 4 : 2、1 : 4 : 4、1 :6: 4、1 :8: 4进行组合。其他条件按照表1所 列进行优化 表1RT-LAMP反应体系
采用上述配比对所提取的核酸进行扩增，63Γ水浴1小时，每组均采用复管进行实验。
[0021]2)优化结果：从多次重复试验中发现，优化后外引物：内引物：环引物的最佳比例 为1:8:4,其中外引物浓度为5nM，内引物浓度为40nM，环引物浓度为20nM。
[002引 3、酶混合物：浓度均为抓/μL的AMV反转录酶与8U/μL的BstDNA聚合酶按1 : 1比例混匀分装； 4、目视巧光染料。
[002引 5、DEPC水：内含浓度为1%。的焦炭酸二乙醋。
[0024] 6、阴性对照：d地20。
[002引 7、阳性对照：利用鸭黄病毒E基因构建的假病毒颗粒。
[0026] 实施例2.本发明的检测鸭黄病毒的方法 一、样品处理 样品按照QIAgenRNeasyMiniKit的说明书进行提取，或者采用等效的RNA提取试剂。 提取的RNA于-80°C保存，备用。
[0027] 二、RT-PCR扩增反应 (一）扩增试剂准备：从试剂盒中取出RT-LAMP反应液、酶混合物、引物混合液及目视巧 光染料在室溫下融化后，20(K)r/min离屯、5s。设所需PCR管数为η(n=样品数+1管阴性对 照+1管阳性对照）。每个测试反应体系配置如下表2: 表2.配置体系
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积EP管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分 装20化。
[002引 仁）加处理后的样品 在各设定的PCR管中，分别加入上述样品处理步骤中制备的RNA溶液各5化，盖紧管盖， 于4000r/min离屯、5s。将PCR管排好，放入水浴锅或PCR仪内。
[0029] (S)RT-LAMP反应 条件为：63°C解育1小时。
[0030] 三结果判定 (一）质控标准 1、目视检测方法（图1) 阴性对照目视呈浅橘红色。
[0031] 阳性对照目视呈巧光绿色。
[0032] 2、浊度检测方法（图1) 阴性对照离屯、后，管底无沉淀。
[0033] 阳性对照离屯、后，管底有白色沉淀。
[0034] 3、凝胶电泳检测方法姻2) 阴性对照电泳无条带 阳性对照电泳可见从点样孔的拖尾现象W及很多不同扩增长度的条带。
[0035] (二）结果描述及判定 在阴阳性对照成立的前提下，选择一种检测方法进行判定。
[003引 1、目视检测方法 目视呈浅橘红色为阴性，目视呈巧光绿色为阳性。
[0037] 2、浊度检测方法 离屯、后，管底无沉淀的为阴性，管底有白色沉淀为阳性。
[003引 3、凝胶电泳检测方法 电泳后，无条带的为阴性，可见从点样孔的拖尾现象W及很多不同扩增长度条带的为 阳性。
[0039] 实施例3、本发明的RT-LAMP方法检测鸭黄病毒的特异性试验和灵敏性试验 将建立的RT-LAMP检测方法检测不同稀释度的鸭黄病毒鸭胚尿囊液并与RT-PCR方法 比较，评估该方法的灵敏度；用RT-LAMP检测方法检测常见禽类病毒，W评估该方法的特异 性。
[0040] -、材料 1. 鸭黄病毒RT-LAMP检测试剂盒镇施例1) 2. 禽流感病毒册N1亚型（AIV)、鸭病毒性肠炎病毒（DEV)、鸭病毒性肝炎病毒（DVH)等 均由山东出入境检验检疫局动检科保存。
[0041] 3SPF鸭胚：购自山东省农科院家禽研究所 二、检测鸭黄病毒特异性试验和灵敏性试验的方法 1.灵敏性试验 将鸭黄病毒的感染尿囊液做1〇1、1〇2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇7、1〇8、1〇9倍稀释，提取RNA， 分成两份，一份做用试剂盒做RT-LAMP，一份做普通RT-PCR。
[004引 2.特异性试验 利用本研究建立的RT-LAMP检测方法，对所有鸭黄病毒及实验室保存的AIV、DEV、DVH进行检测，确定RT-LAMP方法的特异性。
[004引三结果 1.运用优化的RT-LAMP检测方法与RT-PCR的方法对10倍梯度稀释的病毒尿囊液RNA同时进行检测，结果显示，RT-LAMP方法的灵敏度比RT-PCR方法高10倍，见图3。
[0044] 2.为验证所建立的RT-LAMP检测方法的特异性，分别W鸭黄病毒、禽流感册N1亚 型、鸭病毒性肠炎病毒（DEV)、鸭病毒性肝炎病毒（DVH)的核酸为模板进行检测，结果显示 仅鸭黄病毒可扩增出条带并见到绿色巧光，方法的特异性良好（图4)。
【主权项】
1. 一种鸭黄病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分： RT-LAMP反应液：内含浓度为 8mmol/LMgS04, 5. 6mmol/LdNTPMixture; 2 )引物混合液；检测鸭黄病毒的引物组按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB为5nM: 5nM: 40nM: 40nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所涉及的检测引物序列为： 上游内引物FIP序列： 5' -GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG-3' ； 下游内引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3' ； 上游外引物F3序列： 5'-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3' ； 下游外引物B3序列： 5'-CCCATGTCAACCCCAGATC-3' ； 上游环引物LF序列： 5'-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3' ； 下游环引物LB序列： 5'-ACCGCTGAGATGGAGGATTATG-3' ； 3) 酶混合物：浓度均为5U/μL的AMV反转录酶与8000U/mL的BstDNA聚合酶按1 :1 比例混匀分装； 4) 目视荧光染料； 5. DEPC水：内含浓度为1%。的焦炭酸二乙酯； 6) 阴性对照：ddH20 ; 7) 阳性对照：利用鸭黄病毒E基因构建的假病毒颗粒。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭黄病毒RT-LAMP检测试剂盒，试剂盒包括以下组分：1）RT-LAMP反应液；2）引物混合液；3）酶混合物；4）目视荧光染料；5）DEPC水；6）阴性对照；7）阳性对照。检测方法具体步骤是：采集样品后提取核酸RNA，利用试剂盒进行PCR扩增，反应结束后进行结果检测。本发明的有益效果为：1）快速：从样品处理到出结果仅需2小时左右；2）实现了一步法RT-LAMP检测鸭黄病毒的目的；3）灵敏：使用该方法比传统PCR方法灵敏度高10～100倍；4）特异：与常见禽类其他病毒不发生交叉反应；5）操作简单，具有良好重复性。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105331746
【申请号】CN201510915939
【发明人】王群, 徐彪, 张晓文, 郑小龙, 孙涛, 姜帆
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月10日