一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的hrm检测方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，具体设及一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒 病毒的HRM检测方法及引物。
【背景技术】
[0002] 小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler'Smurineenc巧halomyelitisvirus,TMEV)属于微 RNA病毒科，屯、病毒属（仍ri/ioKir化?)。核酸为负链单股RNA，基因组大小约SlOObp。小鼠 脑脊髓炎病毒在小鼠群中广泛存在，感染率达8%~35%。该病毒多数呈隐性感染，主要侵害 小鼠中枢神经系统，导致脑脊髓炎，临床表现为后肢麻搏，偶尔波及前肢。近年研究发现，大 鼠也可W自然感染TMEV病毒，大鼠乳鼠脑内接种TMEV病毒可W导致动物发生后肢擁痕、被 毛蓬乱和体重减轻等症状。TMEV不仅对实验动物本身造成危害，还对科学研究工作造成潜 在干扰，是国标中SPF级小鼠需要排除的病原体。
[0003] 目前，TMEV感染诊断方法主要是免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA)、 免疫酶试验（IEA)和免疫巧光试验（IFA)等，但是运些方法中不能应用于免疫功能低下或 免疫缺陷动物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反 应，此外，抗体检测方法不适用于病毒早期感染的诊断。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方 法既复杂又繁琐，不利于日常检测。普通RT-PCR方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点，已 成为TMEV病毒感染诊断的重要手段。
[0004] 大鼠泰勒病毒（Rattheilovirus，RTV)，也称为大鼠疑似泰勒病毒 (Theiler's-Ukevirusofrats)或大鼠脑脊髓炎病毒（Ratence曲alomyelitisvirus), 是近些年新发现一种感染大鼠的屯、病毒属病毒。RTV的理化特征与TMEV相似，而且RTV与 TMEV之间有抗原交叉反应。最近研究报道表明RTV是目前大鼠流行的病毒之一，感染率为 0.6%~54. 4%。国外实验动物机构和国内一些CR0公司都把RTV列为日常健康监测中的一 个常规检测项目。目前RTV的检测方法主要是化ISA方法，但是一些检测机构采用TMEV作 为包被抗原进行大鼠RTV检测，因此不能鉴别是TMEV感染还是RTV感染。PCR检测也是RTV 诊断的一种有效方法。
[0005] 综上所述，TMEV和RTV主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法。免疫学方法主 要是检测血清中是否存TMEV和RTV的特异性抗体，具体是用ELISA、IFA和MFIA等方法进 行检测，然而运种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上 述两种病毒之间有抗原交叉性，其特异性难W保证，因此不能进行鉴别。核酸检测方法具有 快速、灵敏、特异、直观等特点，消除了常规免疫学检测方法中非特异性因素的干扰及敏感 性问题，可W对TMEV和RTV进行鉴别诊断。常用的核酸检测方法主要包括普通PCR方法和 巧光定量PCR检测方法。普通PCR方法需要开盖对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够 简化，而且容易产生气溶胶污染，导致出现假阳性。巧光定量PCR检测方法需要设计巧光标 记探针，价格比较昂贵，限制了该方法的推广应用。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠 泰勒病毒的HRM检测方法及引物。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法的引物，其核巧酸序 列如下所示： 上游引物P1:ATTTGAAAGCAATGGTTAGC(沈QIDN0:1); 下游引物P2:GATCGAGAGGATGTTCATCTAA(沈QIDN0:2)。
[0008] -种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测试剂盒，所述试剂盒 含有上述引物。
[0009] -种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，包括W下步 骤： 1) 从样品中提取病毒核酸； 2) W核酸为模板，用上述引物对P1和P2W及巧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应获 得扩增产物； 3) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
[0010] 优选的，RT-PCR扩增反应体系如下： 模版RNA 1~5μ1 PrimeScript1stepEnzymeMix 0.8μ1 上游引物PI(l〇ymol/L) 1μ1 下游引物P2 (10ymol/L) 1μ1 2X1StepBuffer 10μ1 LCgreen染料 1μ1 加RNAfree(1地2〇 补足至 20μ1。
[0011] 优选的，扩增反应程序如下： 50°C反转录 30min;94°C预变性 3min;94°C变性 20sec、55°C退火 20sec、72°C延伸 20sec，循环40次；72°C终延伸5min;HRM分析设定的烙解速率为0. 3°C/sec。
[0012] 一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，包括W下步 骤： 1) 从样品中提取病毒核酸； 2) 将样品核酸反转录获得cDNA，WcDNA为模板，用上述引物对P1和P2W及巧光饱和 染料，进行二次扩增反应获得扩增产物； 3) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
[0013] 优选的，二次扩增反应体系如下： cDNA 2μ1 PremixExTaq 10μ1 上游引物PI (l〇ymol/L) 1μ1 下游引物P2 (10ymol/L) 1μ1 LCgreen染料 1μ1 加RNAfree(1地2〇 补足至 20μ1。
[0014] 优选的，二次扩增反应程序如下： 94°C预变性 3min;94°C变性 20sec、55°C退火 20sec、72°C延伸 20sec，循环 40 次；72°C终延伸5min;HRM分析设定的烙解速率为0. 3°C/sec。
[0015] 优选的，步骤3)中HRM分析的具体分析方法为：w小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品 作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，则判定为 小鼠脑脊髓炎病毒；W大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大 鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，则判定为大鼠泰勒病毒。
[0016] 优选的，步骤3)中HRM分析的具体分析方法为：W小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准 品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，同时 其Tm值为80. 27 + 0. 78°C，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；W大鼠泰勒病毒阳性标准品作 为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为 83. 30 + 1. 32°C，则判定为大鼠泰勒病毒。
[0017] 本发明的有益效果是： (1)本发明首次建立了一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方 法W及引物，该方法操作简单：只需PCR反应之前加入巧光饱和染料即可；检测速度快且高 通量，全部操作过程只需3小时，根据仪器配制一次可完成72/100或96/384孔板的PCR产 物检测；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6元；准确性高、特异性 好，重复性好，可W准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
[0018] (2)本发明所设计的引物特异性好，只能特异性扩增出小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠 泰勒病毒，与其他大小鼠病毒如小鼠肝炎病毒（MHV)、大鼠冠状病毒（RCV)、小鼠诺如病毒 (MNV)、呼肠孤病毒III型（Reo-3)、仙台病毒（SV)、小鼠肺炎病毒（PVM)、汉坦病毒（HV)、 淋己细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV)、小鼠细小病毒MVM株（MVM)、小鼠细小病毒MPV株 (MPV)、大鼠细小病毒KRV株（KRV)、大鼠细小病毒H-1株（H-1)、鼠痘病毒（Ect)、小鼠腺病 毒（Mad)、多瘤病毒（Poly)、小鼠巨细胞病毒（MCMV)无交叉反应。
[0019] (3)本发明方法灵敏度高，可W检测到1.OXlOicopies/μ1的TMEV和RTV质粒标 准品。
[0020] (4)本方法不需要进行PCR产物的分离，真正实现了闭管操作，避免污染；同时对 PCR产物无损害，检测后还可W进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。
【附图说明】
[0021] 图1是TMEV和RTV质粒标准品PCR的电泳图，泳道1、2、3为TMEV质粒标准品，泳 道4、5、6为RTV质粒标准品，泳道7、8为阴性对照，泳道Μ为化2000DNAMarker; 图2是TMEV和RTV模拟峰型化烙解曲线图； 图3是T