专利名称：悬浮吸附增殖甲型肝炎病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种甲型肝炎减毒活疫苗的生产方法，尤其是采用悬浮吸附方法增殖甲型肝炎病毒疫苗的方法。
甲型肝炎病毒在大多数组织培养系统中增殖缓慢、且滴度偏低，给制备疫苗(包括死、活疫苗)和诊断试剂病毒抗原带来很大困难，如何提高病毒产量和缩短病毒增殖周期是其关键所在。就我国目前生产甲型肝炎减毒活疫苗的工艺方法而言，H2-KMB17系统和L-A-1-2BS系统虽然功能稳定，但产毒周期长，一个生产周期需32-40天，极大影响了我国甲型肝炎减毒活疫苗，灭活疫苗及诊断试剂病毒抗原的生产。
本发明的目的在于提供一种悬浮吸附增殖甲肝病毒的方法，以便进一步缩短甲型肝炎减毒活疫苗、灭活疫苗、诊断试剂病毒抗原的生产周期和提高病毒的产毒量。
本发明的具体方案是以人胚肺二倍体细胞或适合于甲肝病毒增殖的其它细胞为基质接种甲肝毒种，经培养繁殖、氯仿抽提、各种生物学检测获得甲肝减毒活疫苗，其增殖甲肝病毒的工艺步骤是1、将接种用的基质细胞用胰酶-EDTA消化分散为单个细胞，加入Eagle及0.15-0.30%乳蛋白营养液制成浓缩细胞液，使其浓度为每毫升含100-150万个细胞;
2、在上述细胞液中按0.05-0.2MOI接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种，在4-37℃温度下进行悬浮吸附30-90分钟，悬浮吸附采用搅拌器，以每分钟30-100转的转速进行搅拌;
3、将搅拌后的细胞、病毒混合液用Eagle及0.15-0.3%乳蛋白营养液稀释扩量10-15倍，使每毫升生长液中含有细胞9-13万个，并以此溶液量为基础加入5-10%小牛血清培养繁殖20-28天，培养温度为32-35℃，培养期间可更换1-2次维持液;
4、将培养到期的病毒细胞弃上清，经洗涤消化沉淀，用平衡盐溶液重新悬浮感染细胞并收集置-20℃以下保存;
5、经超声，冻融处理后，用氯仿抽提即得疫苗半成品，经各种生物学检测后分装为疫苗成品。
本发明与现有技术相比具有下列优点1、在接种毒种时，无需待细胞形成细胞单层，而是将细胞消化分散为单个细胞后直接接种甲肝病毒毒种，在节省细胞生长时间的同时，使单个细胞更容易与病毒颗粒发性碰撞，因此可大大缩短病毒的增殖周期。
2、采用悬浮吸附，使单个细胞与病毒颗粒在悬浮搅拌中更易接触，使病毒很快吸附到细胞上，早期进入细胞，并随细胞的分裂极易扩增感染细胞，因此在缩短病毒增殖周期的同时还提高病毒的产毒量;采用悬浮吸附可简化生产过程缩短生产周期，节省原材料，提高病毒产量，在省时、省力的同时，还降低了生产成本。
另外本发明适用于其它甲肝病毒株和其它细胞，甲型肝炎灭活疫苗的病毒增殖以及诊断试剂的甲型肝炎病毒抗原的生产。
实施例1将足够的人胚肺二倍体细胞用胰酶-EDTA消化分散为单个细胞后，加入不含新生牛血清的Eagle及0.15-0.3%乳蛋白营养液制成浓缩细胞液，使每毫升溶液中含有100-150万个细胞，按0.05-0.2MOI加入甲型肝炎减毒活疫苗毒种，将其置4℃冰箱中，用磁力搅拌60分钟，加入Eagle及0.15-0.30%乳蛋白营养液稀释扩量，使每毫升溶液含有细胞9-13万，并补充5-10%新生牛血清，置35℃(静止或旋转培养均可)培养24天，其间可换1-2次维持液，弃原维持液，用PBS洗涤，胰酶-EDTA消化并收集细胞，沉淀弃PBS液，加入适量平衡盐溶液重新悬浮，冻融3次，温度为-20℃以下，间以超声处理，每次3-10分钟(375-1500W超声波仪)，使细胞破碎，用等量分析纯氯仿抽取病毒2-3次，10，000rpm离心30分钟去除沉淀，合并上清液得疫苗半成品，经各种生物学检测后用平衡盐溶液稀释分装制成疫苗成品。
实施例2本实施例除了悬浮吸附温度采用25℃，悬浮搅拌时间采用30分钟，培养天数为20天外，其余过程均与实施例1相同。
权利要求
1.一种采用悬浮吸附增殖甲型肝炎病毒的方法，以人胚肺二倍体细胞或适合于甲肝病毒增殖的其它细胞为基质接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种，经培养繁殖、氯仿抽提，各种生物学检测获得甲肝减毒活疫苗，其特征在于采用下列工艺步骤接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种a、将基质细胞用胰酶-EDTA消化分散为单个细胞，加入Eagle及0.15-0.30%乳蛋白营养液制成浓缩细胞液，其浓度为每毫升溶液含100-150万个细胞；b、在上述细胞液中按0.05-0.2MOI接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种，在4-37℃温度下进行悬浮吸附30-90分钟；c、将悬浮吸附的细胞、病毒混合液用Eagle及0.15-0.3%乳蛋白营养液稀释扩量10-15倍，使每毫升生长液中含有细胞9-13万个，并以此溶液量为基础加入5-10%小牛血清培养繁殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于b过程的悬浮吸附采用搅拌器以每分钟30-100转的转速进行搅拌。
全文摘要
本发明涉及一种悬浮吸附增殖甲型肝炎病毒的方法。将细胞基质用胰酶——EDTA消化分散后接种甲肝活疫苗毒种，经培养繁殖、氯仿抽提和各种生物学检测后分装成甲肝疫苗成品。本发明可在节省细胞生长时间的同时，缩短病毒增殖周期，提高病毒的产毒量，另外可简化工艺过程，节省原料，降低生产成本。
文档编号C12N7/00GK1101941SQ9410125
公开日1995年4月26日 申请日期1994年1月27日 优先权日1994年1月27日
发明者曹逸云, 周德久, 董德祥, 胡云章, 阳选祥, 陈统球, 刘开明, 白惠珠, 张瑞菊, 杨净思 申请人:中国医学科院医学生物研究所