一种对软骨组织进行分析的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及软骨组织工程技术领域，特别涉及一种对软骨组织进行分析的方法。
【背景技术】
[0002]软骨组织是一种在机体内主要起支持和保护作用的略带弹性的坚韧组织，由软骨细胞、软骨基质及纤维构成。其中，软骨基质占软骨组织干重的90%左右。胎儿和幼儿的软骨组织分布较广，而成年人软骨组织主要分布在关节、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。其中，关节软骨作为能动关节的承重组织，不仅能承受相当大的负荷，例如约ISMPa的应力，还能减少相邻两骨的摩擦，缓冲关节运动时产生的震动，对于关节的正常活动至关重要。研宄发现，关节软骨易受到疾病或创伤的影响而遭到破坏，但是由于其本身不含血管或神经，所以遭到破坏后缺乏自我修复能力，这意味着对关节软骨较小的损害既能造成明显的关节疼痛、关节不稳，并逐渐演变成骨关节炎。所以，对受损的关节软骨的修复一直是医学界关注的重点和难点。
[0003]举例来说，自20世纪40年代至今以来，兴起了一批对受损的关节软骨进行修复的方法，包括清创灌洗手术、骨髓刺激技术、骨软骨移植、以及软骨组织工程技术等。其中，软骨组织工程技术作为近年来的研宄热点，通过将软骨种子细胞种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种子细胞形成新的软骨来填充软骨缺损，具有极大的应用前景。
[0004]在软骨组织工程技术的研宄过程中，对软骨组织，尤其是软骨基质进行定性和定量分析十分重要。通过对软骨组织，尤其是软骨组织中的软骨基质进行定性和定量分析而得到的软骨信息不仅能实时监测软骨修复效果还能为临床软骨诊断及治疗提供生理参数。目前通常采用软骨组织切片技术对软骨进行定性和定量分析。软骨组织切片技术主要是通过将软骨组织样品进行切片(厚度约为7微米，面积约为2cm2)，再进行染色处理(包括固定、脱钙、脱水、包埋操作)，然后才能在显微镜下进行观察软骨的形态。
[0005]发明人发现现有技术至少存在以下问题:
[0006]现有技术切片区域和厚度较小，所获得的软骨信息较为片面，精确度较低。而且，软骨组织样品为一次性使用，无法进行其他应用，造成软骨组织样品耗费严重。
【发明内容】
[0007]本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供了一种既能获得全面精确的软骨信息又能使软骨组织样品多次利用的对软骨组织进行分析的方法。具体技术方案如下:
[0008]一种对软骨组织进行分析的方法，包括:
[0009]步骤a、利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，得到所述软骨基质自发荧光的激发条件；
[0010]步骤b、在所述软骨基质自发荧光的激发条件下，采用包括X轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用所述双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，其中，所述全层扫描包括:对所述软骨组织样品在所述Z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述软骨组织样品中每个子层的软骨基质产生自发荧光，从而获取所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像；
[0011]步骤C、选取所述N个子层中任意一个子层作为第一子层，将所述第一子层的软骨基质的自发荧光图像作为第一荧光图像，根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量，从而完成对所述软骨组织样品的定量分析；
[0012]步骤d、利用所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像，重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像；
[0013]步骤e、根据所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像，得到所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，从而完成对所述软骨组织样品的定性分析。
[0014]进一步地，所述方法还包括:在所述步骤b之后，对所述软骨组织样品中的细胞核及细胞骨架进行染色，然后进行荧光扫描处理，获取所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像；
[0015]根据所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，对所述软骨组织样品进行定性和定量分析。
[0016]更进一步地，所述方法还包括:
[0017]选取所述N个子层中任意一个子层作为第二子层，从所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像中选取所述第二子层的软骨基质的自发荧光图像，作为第二荧光图像；
[0018]从所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像中选取所述第二子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，作为第三荧光图像；
[0019]将所述第二荧光图像与所述第三荧光图像进行集成处理，获取所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像；
[0020]根据所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像，对所述第二子层的软骨组织样品进行定性和定量分析。
[0021]具体地，所述步骤a中，所述软骨基质自发荧光的激发条件包括:
[0022]用于激发所述软骨基质自发焚光的激光波长为405nm、488nm、56 Inm和633nm ；
[0023]用于采集来自所述软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为100-1300nm；
[0024]用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；
[0025]电子放大倍数为0-40 ；
[0026]用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为1-16通道。
[0027]具体地，所述根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量包括:
[0028]利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度，根据所述荧光强度得到所述第一子层的软骨基质的含量。
[0029]具体地，在利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度的过程中，在所述第一荧光图像中选取至少2个测试点，并测定所述至少2个测试点的荧光强度，取平均值，得到所述第一荧光图像的荧光强度。
[0030]具体地，所述步骤d中，利用三维细胞结构生物显微影像分析处理软件对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建处理，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。
[0031]具体地，所述三维细胞结构生物显微影像分析处理软件为瑞士 Bitplane公司开发的Imaris软件。
[0032]具体地，所述步骤d包括:利用所述Imaris软件中的Slice程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行层扫分析，确定所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置；
[0033]根据所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置，利用所述Imaris软件中的Surpass程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。
[0034]具体地，所述步骤e包括:利用所述Imaris软件中的Sect1n程序对所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像进行层切处理，获取所述软骨组织样品的多个纵切面和/或横切面的图像，并根据所述多个纵切面和/或横切面的图像，确定所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，来对所述软骨组织样品进行定性分析。
[0035]本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:
[0036]本发明实施例提供的对软骨组织进行定性和定量分析的方法，通过采用双光子共聚焦显微镜中的包括X轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，即xyz扫描方式，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品中的软骨基质激发自发荧光，获取该软骨组织样品中各个不同的连续的子层的软骨基质的自发荧光图像。一方面，根据所得到的自发荧光图像能确定特定子层的软骨基质的含量，从而对软骨组织进行定量分析。另一方面，通过对所得到的自发荧光图像进行三维重建处理，构建软骨组织样品中软骨基质的三维图像，能够对软骨组织进行定性分析。可见，本发明实施例提供的方法能对整个软骨组织样品进行定性定量分析，所获得的软骨信息更加全面精确，利于实时监测软骨修复效果并为临床软骨诊断及治疗提供精确的中间信息。而且该方法对软骨组织样品不具有破坏性，软骨组织样品还可进行再利用，避免了浪费。
【附图说明】
[0037]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0038]图1-1为SD大鼠膝关节的软骨基质的自发荧光图像；
[0039]图1-2为SD大鼠膝关节的软骨下骨的自发荧光图像；
[0040]图1-3为人膝关节的软骨基质的自发荧光图像；
[0041]图1-4为人膝关节的软骨下骨的自发荧光图像；
[0042]图1-5为人膝关