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【主权项】
1. 用于转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，其特征在 于，所述引物和探针组合为： 外源基因正向引物：5' -GCGCACGCAAITCAACAG-3' 外源基因反向引物：5' -GGTCATAACGTGACTCCCTTAAITCT-3' 外源基因探针：5' -FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-BHQ1-3' 内参基因 hmga 正向引物：5' -ITGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3' 内参基因 hmga 反向引物：5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' 内参基因 hmga 探针：5' -VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。2. 含有权利要求1所述引物和探针组合的转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量 检测试剂盒。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg' PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。4. 转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤： 1) 提取待测样品的基因组DNA ; 2) 以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合，进行数字PCR 扩增反应； 3) 检测PCR扩增产物。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中数字PCR扩增反应的反应体 系以4y 1计为：基因组DNA Iy l，225nM外源基因正、反向引物各0. 04y l，225nM内参 基因正、反向引物各0. 04y l，50nM外源基因探针0. 02y l，50nM内参基因探针0. 02y 1， 2XMasterMix 2yl，20XLoading Reagent 0.4111，（1(11120补足至4111〇6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行数字PCR扩增反应的程序 为：50°C热激活300s ;95°C预变性300s ;95°C变性15s，60°C退火及延伸60s，共50个循环； 在60 °C下米集焚光信号。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。8. 根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物具 体如下：在数字PCR扩增反应结束后，记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值， 通过泊松分布公式计算各反应孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比 得到转基因成分的绝对浓度。
【专利摘要】本发明提供一种针对转基因玉米MIR604的双重数字PCR荧光定量检测方法，本方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米MIR604进行定量检测，从而省去了常规PCR方法定量检测中标准曲线绘制步骤以及现有数字PCR检测中的样品前处理步骤，另外，在本方法中，由于转基因成分是通过外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检测可以提高转基因成分定量检测的稳定性。利用本方法可实现对转基因玉米MIR604的绝对定量检测，定量检测限可达到0.5％，灵敏度可达到0.1％，能够满足所有转基因成分实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种转基因绝对定量检测的有效方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105112531
【申请号】CN201510585914
【发明人】付伟, 朱鹏宇, 杜智欣, 王晨光, 魏霜, 张亮亮, 彭萱子, 朱水芳
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月15日