一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 茶树[Camelliasinensis(L. )0?Kuntze]是一种重要的经济作物，是21世纪最流 行的健康饮料植物之一。中国是茶树的原产地，产茶历史悠久。近年来，中国茶产业快速 发展，产业规模不断扩大，茶园种植面积、产量、出口数量和金额屡创新高。同时，二十世纪 九十年代开始全国各地挖掘、恢复历史名茶和创制新名茶并举，名优茶数量不断增加，质量 逐年提高，市场全面开拓。苏州洞庭碧螺春茶作为全国著名历史名优茶之一，碧螺春茶产于 苏州太湖洞庭，该地气候湿润温和、常年云雾弥漫，良好的生态环境、适宜的茶树品种和精 细的加工工艺，成就了碧螺春茶的独特品质，其外形条索纤细、色绿隐翠、茸毫披覆、卷曲似 螺、内质汤色嫩绿、香气鲜雅、兰韵突出，滋味鲜醇、回味绵长，叶底柔嫩，因此以形美、色艳、 香浓、味醇"四绝"以及悠久的帝王传说享誉海内外。2002年12月，洞庭碧螺春茶列为国家 原产地保护产品（GB18957-2003)。
[0003]目前，苏州"洞庭碧螺春"茶的茶树群体种以小、中叶型灌木为主。根据苏州市吴 中区农林局林业站统计：目前东西山共有28000余亩茶园，其中洞庭地方群体茶树品种茶 园18000多亩，年产茶叶276吨，其中碧螺春128吨，茶叶总产值15000万元左右，其中碧螺 春产值12500万元左右。洞庭山茶树通常称为东、西山群体中小叶型，嫩梢较长，重量较轻。 东、西山群体种以"柳叶条"、"酱板头"、"柴茶"等小叶茶树品种为代表，这些茶树品种适宜 制作洞庭碧螺春，是目前洞庭碧螺春原产地主导茶树品种。
[0004]目前，碧螺春茶因其在茶叶市场中价值高、功效多的特性而不可避免地遭到了仿 冒，因此有必要对名优茶的品质真伪进行鉴别，以保护品茶爱好者的利益，维持名优茶市场 的公平公正性。感官判别和理化检测是最常用的茶叶品质鉴别方法，但感官的判别方法受 品茶师的个人经验、心理和生理因素等影响，往往判别结果的准确性和重复性差；理化检测 的方法只限于某些茶叶内部特定组分的分析，而且分析流程多，成本高。
[0005] 近年来，分子生物学和生物技术迅速发展，遗传标记技术在此基础上也得到了迅 猛发展。分子标记作为继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后一种新的遗传标记技术， 发展时间虽短但具有广阔的应用前景和巨大的应用潜力，在遗传图谱构建、群体遗传结构 和多样性分析、物质演化和亲缘关系研究中具有重要意义。目前，分子标记技术已在茶树 研究中广泛应用，取得较多进展，并且研究也不断改进。在茶树中应用较多的分子标记技 术为限制性内切酶片段长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性DNA标记（RAPD)、简单序列重 复（SSR)、扩增片段长度多态性（AFLP)、单核苷酸多态性（SNP)等。虽然RFLP、RAPD、SSR、 AFLP在分子标记技术中具有各自的优点，但是也存在实验操作繁琐、检测周期长、成本高等 缺点。单核苷酸多态性（SNP)作为最常见的一种可遗传变异，广泛存在动植物基因组中。 SNPs是指基因组水平上，单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性，为第三代分子标记的代 表。SNP包括两种形式，碱基的转换或碱基的颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强， 基因编码区的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于 自动快速检测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。
【发明内容】
[0006] 发明目的：本发明的目的是提供一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法。本发明利用 分子标记技术克服了感官判别和理化检测方法的不足，利用SNP差异位点，最终达到碧螺 春茶品质真伪快速鉴别的目的检测。
[0007] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种碧螺春商品茶的分子鉴定 方法，包括以下步骤：
[0008] 1)确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个 基因序列；
[0009] 2)引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物， 并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物；
[0010] 3)基因组DNA提取；
[0011] 4)PCR扩增及检测；
[0012] 5)将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱 基序列如SEQIDN0 :25~30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差 异碱基序列的相似性达到99. 5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。
[0013] 其中，上述引物的设计长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50°C-60°C， GC含量在40% -60 %之间。
[0014] 其中，上述基因组DNA提取采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要 操作步骤为：
[0015] 1)将0.lg的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至 白色粉末状，并转移至1. 5mL离心管，然后在离心管中加入0. 6mL预热的CTAB提取液并充 分震荡混匀，65°C水浴一小时，期间不断震荡混匀；
[0016] 2)在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5min;
[0017] 3)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心lOmin，吸上清液至新离心管，加入等体积的 氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5min;
[0018] 4)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的 异丙醇混匀后在_20°C下放置lh以上；
[0019] 5)使用离心机在4°C下5000rpm离心5min，弃上清液收集沉淀；
[0020] 6)在离心管中加入高盐缓冲液，在65°C水浴，溶解沉淀；
[0021] 7)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心5min，吸上清液于新离心管；
[0022] 8)在管中加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，混匀，在-20°C放20min;
[0023] 9)使用离心机在4°C下5000rpm离心5min，弃上清液，收集沉淀；
[0024] 10)使用70 %的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀；
[0025] 11)使用300yL超纯水溶解沉淀，加入0. 5RNase使RNA降解；
[0026] 12)使用NanoDropND-1000分光光度计测定浓度和纯度；
[0027] 13)使用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
[0028] 其中，上述PCR扩增反应程序为：94°C预变性lOmin;然后进入循环，每个循环 94°C变性30sec，52~55°C退火30sec，72°C延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72°C延 伸lOmin;4°C冷却后取出扩增产物。
[0029] 有益效果：本发明能够节省成本，以及对于样本量没有限制，克服了直接使用单个 位点进行确认不太准确的问题，本发明通过采用6个SNP位点确定更加准确。该方法简单 易行，稳定可靠，只需极少量样品就可完成，具有很好的实用价值，碧螺春正品，可以用其他 相似茶叶作为代用品，本发明方法能方便地鉴定出碧螺春、能方便地将碧螺春与从形态特 征易与碧螺春混淆的其它茶叶区别开。因此，本发明方法对保护碧螺春的收购及茶叶生产 质量具有十分重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0031] 实施例1:
[0032] 1、材料的选取以及6个SNP位点的确定
[0033] 碧螺春茶叶样品为不同省份碧螺春样品。试验中，碧螺春茶样分别于2013年5-6 月购自江苏、浙江、安徽和福建等产茶名区。碧螺春的6个SNP位点的基因序列参见SEQID NO: 1~6,根据这6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的基因，其基因序列参见 SEQIDN0:7 ~12。
[0034] 表1供试洞庭碧螺春茶树品种（系）来源和原产地
[0035]
[0036] 表2参照茶树品种（系）来源和原产地
[0037]
[0038]
[0039] 表3商品碧螺春茶来源
[0040]
[0041]
[0042] 2、EST_SNP的开发
[0043]在NCBIGenBank中获取（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)茶树EST序列。在 NCBI数据库中获得了 47789条EST序列，这些序列来源于不同茶树品种、不同组织和器官的 cDNA文库。
[0044] (1)去除'噪音'序列：从数据库中直接获取的EST序列往往包含一些低质量的小 片段，同时还带有少量载体序列及末端存在P〇lyA/T"尾巴"的序列，去除这些序列；（2)EST 数据的聚类和拼接：利用Phrap软件进行聚类和拼接；（3)筛选：利用AutoSNP软件进行筛 选，排除旁系同源基因的干扰，并解决测序错误引起的假阳性问题。通过上述方法筛选得到 碧螺春的6个SNP位点的基因序列。
[0045] 碧螺春的6个SNP位点：
[0046]
[0048] 3、引物的设计及扩增
[0049] 使用Primer5. 0软件在候选SNP对应的6个基因序列两侧设计引物，引物设计的 原则为：长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50°C-60°C，GC含量在40% -60% 之间。共设计了 6组引物序列，具体参见序列表SEQIDNO: 13~24。
[0050] 4、基因组DNA提取
[0051] 采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要操作程序为：
[0052] (1)将0.lg左右的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研 磨至白色粉末状，并转移至1. 5mL离心管，然后在离心管中加入0. 6mL预热的CTAB提取液 (2%CTAB，0. 1MTris，20mMEDTA，1.4MNacl，pH8. 0)并充分震荡混匀，65°C水浴一小时，期 间不断震