。
[0043] 实施例2引物对和探针的设计
[0044] (1)本实施例的引物对和探针的序列见表1 :
[004引表1弓I物及探针序列
[0046]
[0047] 似本实施例的实时巧光PCR反应体系见表2:
[0048]其中，TaqMan实时巧光PCR反应程序为：50°C，2min;95°C，10min，90°C，10s，60°C， Imin，45个循环。
[0049] 表2SYBR Green实时巧光PCR反应体系
[0050]
[005。实施例3磐粟成分实时巧光PCR扩增的引物和探针特异性检测
[0052] 选取常见的用于配制复合调味料的香辛调味料，包括桂皮、八角、香叶、小茵香、花 椒、辣椒、孜然共7种，另选取常用药材包括鱼腥草、金银花、紫花地下等共36种，与磐粟种 子一起抽提总DM并纯化，抽提情况见表3和表4,W磐粟种子DM为阳性对照，W超纯水为 阴性对照，利用表2选取的扩增体系对引物进行特异性试验。扩增结果如图1。
[005引表3 7种香辛料中DNA抽提情况[0054]
[0057]
[0058] 结论：引物和探针仅对磐粟种子DM扩增阳性，有明显S型扩增曲线，对其余7种 香辛调味料和36种常用药材扩增阴性，提示该引物和探针特异性好。
[0059] 实施例4实时巧光PCR灵敏度检测
[0060] 将实施例3抽提得到的磐粟种子基因组DNA浓度调整为10化g/ μ L梯度稀释成 long/μ^Ing/μ^lOOpg/l、lOpg/L、Ipg/L共五个浓度梯度，各1μL进行PCR扩增，扩增 Ct值见表5。扩增曲线见图2。
[0061] 表5实时巧光PCR灵敏度试验Ct值
[0062]
[0063] 结论：可W看出随磐粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，在模板使用量为 lOpg时，有明显S型扩增曲线，检出灵敏度达到lOpg。
[0064] 实施例5实时巧光PCR检出限试验
[0065] 将磐粟种子样品研磨粉碎处理后，按照不同的重量比分别添加到不含磐粟成分 的玉米淀粉基质中，抽提获得磐粟含量分别为100%、10%、5%、2%、1 %、0. 1 %、0. 01 %、 0. 001 %共8个梯度的系列稀释品，取每孔long用于PCR扩增，扩增Ct值见表6。扩增曲线 见图3。
[0066] 表6实时巧光PCR检出限试验Ct值
[0067]
[0068] 结论：可W看出随磐粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，0. 01%的模板有 明显的S型扩增曲线，检出限达到0. 01%。
[0069] 实施例6实例验证
[0070] 随机在上海世纪联华超市购买调味料样品8件，提取总DNA，抽提情况见表7。其 中炒菜王未提取得到可供检测的DNA。W磐粟种子DNA为阳性对照，W超纯水为阴性对照， 7个样品各取lOOng进行扩增试验，扩增曲线见图4。
[0071] 表7 8种调味料DNA抽提情况
[0072]
[0073]
[0074]结论：可W看出仅阳性对照出现S型曲线，结果表明该批超市抽取样品中未检出 阳性。
[00巧]本发明建立了磐粟成分的实时巧光PCR检测方法，针对磐粟物种特异基因设计引 物和探针，仅需结合实时巧光扩增曲线图，2小时就能准确检测到调味料中磐粟运一非法添 加物的存在，灵敏度达到lOpg，检出限达到0.01%。
[0076] 综上所述，本发明设计的磐粟成分的实时巧光PCR扩增的特异性引物对和探针不 仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品添加剂或调味品中是否非法添加磐粟 成分提供了一种很好的方法，在食品添加剂和调味品安全领域的检测把关上，具有较好的 应用前景。而且，所述特异性引物对和探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试 剂盒，所述试剂盒除了所述特异性引物对和探针外，还可W包括标准参照物，运对于本领域 的技术人员来说是显而易见的。
[0077]W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 步骤一：以罂粟种子的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物； 步骤二：检测扩增产物的荧光信号； 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增罂粟成分的特异性引物对和罂粟成分的特 异性探针，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示， 所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO. 3所示。2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下： 反应体系为：2XTaqManMastermix12.5 4 1^，引物各1.25 4 1^，探针0.5 4 1^，（1(1!120 4· 5μL，DNA模板 5μL; 反应的条件为：50°C，2min;95°C，lOmin，90°C，10s，60°C，lmin，45 个循环。3. -种罂粟成分的检测试剂盒，其特征在于，含有以下试剂： (a) 扩增罂粟成分的特异性引物对； (b) 罂粟成分的特异性探针； 其中，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示， 所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO. 3所示。4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括： (c) 标准参照物。5. -种如权利要求3或4所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于 检测调味品或食品添加剂中的罂粟成分。6. -种如权利要求1所述的罂粟成分的特异性引物对和探针，其特征在于，所述特异 性引物对的序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示，所述特异性探针的序列如SEQID NO. 3所示。
【专利摘要】本发明公开了一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：步骤一：以罂粟种子的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增罂粟成分的特异性引物对和罂粟成分的特异性探针。本发明的罂粟成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品添加剂或调味品中是否非法添加罂粟成分提供了一种很好的方法，具有较好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105368942
【申请号】CN201510797053
【发明人】杨捷琳, 高琴, 宗凯
【申请人】上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月18日