mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为75 :25 ;流动相的 流速：lml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0046] 实施例3
[0047] (1)制备供试品溶液
[0048] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1. 0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0049] (2)高效液相色谱检测
[0050] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80 :20 ;流动相的 流速：lml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0051] 实施例4
[0052] (1)制备供试品溶液
[0053] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1. 0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0054] (2)高效液相色谱检测
[0055] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为20μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80 :20 ;流动相的 流速：lml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0056] 实施例5
[0057] (1)制备供试品溶液
[0058] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1. 0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0059] (2)高效液相色谱检测
[0060] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为20μ1，色谱 条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX Carbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5 μ m，规格为4. 6mmX 250mm ;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80 :20 ;流动相的 流速：1. 5ml/min ;色谱柱温：30°C ;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0061] 实施例6
[0062] (1)制备供试品溶液
[0063] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0064] (2)高效液相色谱检测
[0065] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80 :20 ;流动相的 流速：1. 5ml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0066] 为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
[0067] 试验例1
[0068] (1)制备供试品溶液
[0069]取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0070] 流动相的制备方法：量取650ml乙腈，加入用0. 22μm滤膜过滤后的超纯水，定容 至1000ml，混勾后，即得。
[0071] 以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
[0072] 蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0. 5g，用超纯水溶解并定容至500ml， 用0. 22μm滤膜过滤，超声后，备用。
[0073] 甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2. 0g，用超纯水溶解并定容至 500ml，用0. 22μm滤膜过滤，超声后，备用。
[0074]融合蛋白原液的制备方法如下：
[0075] 1、rhTNFRII-Fc融合蛋白表达载体的构建
[0076] 采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体（ATCC产品）中的dhfr(二氢 叶酸还原酶）表达单元克隆到P⑶NA3. 1(+)载体（Invitrogen公司产品）中，构建可表达 DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBFOl。
[0077] 根据hTNFRII的基因序列（Genebank登记号AH006638)和人IgGIFc片段基因序 列（W09411026)分别设计引物进行PCR扩增，并克隆至PUC18质粒中。
[0078] 重新设计引物，对上述获得的hTNFRII和人IgGIFc的cDNA片段进行重叠 (overlap)PCR扩增，以得到rhTNFRII-Fc融合蛋白全长cDNA片段，并采用DNA重组 技术将其克隆到PBF01载体中，构建可表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组表达载体 pBFOl-rhTNFRII-Fc。
[0079] 2、rhTNFRII-Fc融合蛋白工程细胞的构建
[0080] 采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBR)l-rhTNFRII-Fc转染Invitrogen 公司的CH0-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛选高表 达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤）逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达 rhTNFRII-Fc融合蛋白的CH0细胞株CH0-BR)2。
[0081] 3、rhTNFRII-Fc融合蛋白的分离纯化
[0082] 采用批次流加培养方法，得到细胞培养液，并通过Millipore公司的D0HC和B1HC 深层滤器按顺序过滤所得到的细胞培养液，收集滤过液后用ProteinA亲和层析法进行纯 化。
[0083] 将MabselectSuRe(GE公司）层析柱以PBS缓冲液冲洗平衡后，以50~300cm/h 的速度将细胞培养液上清上样，用PBS缓冲液冲洗直至未结合的蛋白全被洗脱（以A280进 行监测），然后用20mmol/L柠檬酸（pH3.5)洗脱融合蛋白，融合蛋白原液收集后用Tris调 节pH值至7. 2。
[0084]自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释融合蛋白原液10倍，备 用。
[0085] (2)高效液相色谱检测
[0086] 采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为10μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZ0RBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为65 :35 ;流动相的 流速：lml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0087] 供试品溶液的检测结果见表1和图1。
[0088] 表1、试验例1条件下对融合蛋白制剂的检测结果
[0089]
[0090]说明：
[0091] 计算蔗糖上样量：根据供试品的蔗糖峰面积与蔗糖对照品的峰面积比值，以及蔗 糖对照品的上样量，通过以下公式计算得到：蔗糖上样量=蔗糖对照品上样量*供试品蔗 糖峰面积/蔗糖对照品峰面积。
[0092] 蔗糖理论上样量：是指供试品中蔗糖理论上的上样量。
[0093] 鹿糖回收率=计算鹿糖上样量/鹿糖理论上样量X100%。
[0094] 类似地，
[0095] 计算甘露醇上样量：根据供试品的甘露醇峰面积与甘露醇对照品的峰面积比值， 以及甘露醇对照品的上样量，通过以下公式计算得到：甘露醇上样量=甘露醇对照品上样 量*供试品甘露醇峰面积/甘露醇对照品峰面积。
[0096] 甘露醇理论上样量：是指供试品中甘露醇理论上的上样量。
[0097] 试验结果表明，本发明在试验例1条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对 融合蛋白制剂中蔗糖和甘露醇的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度均在2. 60以上，符 合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定（规定要求大 于1. 5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
[0098] 试验例2
[0099] (1)制备供试品溶液
[0100] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶 后，流动相