一种二氢杨梅素在促进白血病细胞继续分化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种二氢杨梅素在治疗白血病药物中的应用，更进一步是提供在一种二氢杨梅素在白血病细胞周期阻滞药物或白血病细胞继续再分化药物中的应用。本发明的优点在于，公开了二氢杨梅素在治疗白血病方面的作用机理，具体来说，DHM可以通过诱导白血病细胞的继续分化，从而降低恶性克隆性白血病细胞的克隆能力，减轻其对机体的危害，并促使非正常细胞向正常细胞的分化。本发明为二氢杨梅素治疗白血病提供了理论支撑，填补了二氢杨梅素在治疗白血病应用的空白。
【专利说明】一种二氢杨梅素在促进白血病细胞继续分化药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及二氢杨梅素的应用，更具体地，涉及一种二氢杨梅素在白血病细胞继续再分化药物中的应用。
【背景技术】
[0002]白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位，是一类严重危害人民健康的恶性疾病。因此，寻找与开发治疗白血病，抑制白血病细胞增殖的药物，可有效延长白血病患者的生存时间，并提闻患者的生存质量。
[0003]二氢杨梅素(Dihydromyricetin, DHM),又名蛇葡萄素(Ampelopsin)。提取自葡萄科蛇葡萄属植物藤茶的叶中，属黄酮类化合物，其分子式为C15H1208 (图1)。已有的对二氢杨梅素的研究主要集中 在其保肝护肝作用上，如已证实的DHM可加速乙醇代谢产物乙醛的快速分解，从而降低酒精对肝脏的损害，同时可改善肝细胞损伤引起的血清乳酸脱氢酶活力增加，抑制肝性M细胞胶原纤维形成等。但目前虽然有将二氢杨梅素作为治疗白血病药物的报道，但是对其作用的机理已经最后的作用的方向都没有做相关的研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供二氢杨梅素的新应用。
[0005]本发明提供一种二氢杨梅素在白血病细胞周期阻滞药物中的应用。
[0006]所述的白血病细胞周期阻滞为，阻泄早幼粒白血病细胞在G0/G1期。
[0007]所述的白血病细胞周期阻滞为，对于急性淋巴瘤细胞系U937和慢性髓源白血病细胞系K562，DHM对其周期的阻滞作用则主要发生在S期。
[0008]根据需求再一种二氢杨梅素在白血病细胞继续再分化药物中的应用。
[0009]所述的白血病细胞继续再分化是指提高⑶11和⑶14的表达量。
[0010]本发明的优点如下:
公开了二氢杨梅素在治疗白血病方面的作用机理，具体来说，DHM可以通过诱导白血病细胞的继续分化，从而降低恶性克隆性白血病细胞的克隆能力，减轻其对机体的危害，并促使非正常细胞向正常细胞的分化。本发明为二氢杨梅素治疗白血病提供了理论支撑，填补了二氢杨梅素在治疗白血病应用的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:二氢杨梅素分子式。
[0012]图2:不同浓度二氢杨梅素对HL-60细胞的细胞周期阻滞作用流式结果。
[0013]图3:不同浓度二氢杨梅素对U937细胞的细胞周期阻滞作用流式结果。[0014] 图4:不同浓度二氢杨梅素对K562细胞的细胞周期阻滞作用流式。
[0015]图5:不同浓度二氢杨梅素对HL-60细胞表面抗原⑶11和⑶14表达的影响。
[0016]图6:不同浓度二氢杨梅素对U937细胞表面抗原⑶11和⑶14表达的影响。
[0017]图7:不同浓度二氢杨梅素对K562细胞表面抗原⑶11和⑶14表达的影响。
[0018]图8:不同浓度二氢杨梅素处理HL-60细胞，NBT阳性程度检测结果。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0020]实施例1 二氢杨梅素对白血病细胞系细胞周期阻滞的作用 一、背景简介
细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为G0/G1期:从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体；S期(synthesis):即DNA合成期，在此期，细胞进行DNA合成，同时进行必要的蛋白质合成；G2/M期:DNA合成后期，是有丝分裂的准备期以及有细胞分裂期。
[0021]在一个增殖的细胞群中，并非所有的细胞都是同步增殖的，因此在进行细胞周期检测的时候，同时检测到处于不同周期阶段的细胞。正常情况下在一个细胞群中，处于各阶段的细胞的比例是相对稳定的，但在受到外界不利环境的刺激下，细胞周期图谱会发生变化，使得处于某一阶段的细胞总数突然增多，这种现象称为细胞周期阻滞，即细胞分裂因某种原因停滞在某一时相，而较难以进入下一时相的现象。周期阻滞可以导致细胞内代谢紊舌L从而诱导细胞进一步出现细胞增殖障碍，凋亡或细胞死亡等。
[0022]在细胞周期图谱中，第一道峰(高)所占面积代表G0/G1期细胞占总细胞数的比例；第二道峰(低)所占面积代表G2/M期细胞占总细胞的比例；两峰之间的梯形面积为S其细胞占总细胞的比例。
[0023]二、DHM对细胞周期的抑制作用
主要试验材料:二氢杨梅素(Dihydromyrictin, DHM, Sigma)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成50 mM浓缩液，-20 °C保存，使用时分别稀释为10，20，30，和40 μΜ，即配即
用；细胞周期与细胞凋亡试剂盒(碧云天)。
[0024]试验方法:将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以3X IO5/皿的密度种植于60 mm培养皿中，置于37 °C，5 % CO2培养箱中培养24 h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有10，20，和30 μ M DHM的1640培养液继续培养，24 h后终止培养，按细胞周期与细胞凋亡试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测。
[0025]试验结果:结果显示，DHM对不同类型的白血病细胞均有细胞分裂周期的阻滞作用，从而使细胞不能顺利分裂增殖。但是，不同细胞型在DHM作用下会被阻滞在细胞周期的不同时期。对于早幼粒白血病细胞HL-60，DHM的作用可有效将其细胞周期阻滞在G0/G1期(图2);对于急性淋巴瘤细胞系U937和慢性髓源白血病细胞系K562，DHM对其周期的阻滞作用则主要发生在S期(图3，4)。[0026]实施例2 二氢杨梅素对白血病细胞的继续分化作用 一、背景简介
细胞分化受阻是克隆性白血病的致病原因之一。分化受阻使得大量低分化，无正常功能的细胞在血液中大量增殖，从而导致机体功能异常。通过药物作用使白血病患者血液中低分化的病变细胞能够继续分化成为分化程度较高的功能性细胞，从而降低其无限增殖的能力，并产生正常的细胞功能，是治疗白血病的有效方法之一。
[0027]⑶11和⑶14是细胞表面的抗原标志物，它们的表达量与细胞的分化程度呈正相关，即:未分化细胞的CDll和CD14表达量较低，已分化的功能性细胞，其表面的CDll和CD14增高。
[0028]细胞分化过程耗氧量增加，磷酸已糖旁路代谢活动增强，葡萄糖-6-磷酸氧化脱氢。此时若向其中加入硝基四氮唑蓝(NBT)，NBT中的四氮唑基可接受葡萄糖-6-磷酸脱下的氢，生成甲脘基使原先呈淡黄色的NBT还原生成点状或块状的蓝紫色沉淀，通过检测其吸光度的变化，即可判定细胞是否处于分化阶段。
[0029]本试验证明二氢杨梅素可有效地提高白血病细胞表面⑶11和⑶14的表达量，并并增强白血病细胞中磷酸已糖旁路代谢活动，促进白血病细胞从低分化状态逐渐向功能性细胞分化，从而减少对机体的损害，达到治疗白血病的作用。
[0030]二、二氢杨梅素对⑶11和⑶14表达的影响
细胞系:本试验使用三种不同类型的白血病细胞系:早幼粒白血病细胞HL-60 ;急性淋巴瘤细胞系U937和慢性髓源白血病细胞系K562。
[0031]主要试验材料:DHM，溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成50mM浓缩液，-20 °〇保存，使用时分别稀释为10，20和30 μ M，即配即用；CD11, CD14流式抗体(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium (eBioscience) ;PBS ;60mm 培养皿，流式专用
上样管。
[0032]试验方法:将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60 mm培养皿中，于37°C, 5 % CO2培养箱中孵育约24 h，待细胞生长至占培养皿底部50%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有5，10，20 μ M DHM的培养液继续培养。培养24 h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium消化细胞,将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用4°C预冷的PBS洗涤两次，调整细胞浓度至106/100 μ L，加入抗体，避光孵育20 min，用冷PBS洗去多余抗体，使用流式细胞仪检测CDll和CD14的表达量变化。
[0033]试验结果:在流式图像上，峰的右移表示荧光增强，进一步代表抗原的表达升高。在本试验中，无论是HL-60，U937还是K562，在施加大于20 μ M DHM处理后，峰图均有明显的右移趋势，说明大于20 μ M剂量的DHM可有效诱导白血病细胞的分化(图5~7)。
[0034]三、NBT法检测二氢杨梅素对白血病细胞分化的作用 细胞系:本试验使用的细胞系为早幼粒白血病细胞HL-60
试验材料:DHM，溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成50mM浓缩液，-20 °C保存，使用时分别稀释为10，20和30 μ M，即配即用;硝基四氮唑蓝(NBT，Sigma)溶于PBS中，质量分数为0.2%，4°C保存，配制后一周内使用;胰酶(Gibco) ；PBS ；96孔板(Nunc)。
[0035]试验方法:将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以I X IO4/孔的密度种植于96孔板，置于37 °C, 5 % CO2培养箱中培养24 h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有5，10，20和30 μ M DHM的1640培养液继续培养，24 h后终止培养，向每孔加入10 μ L ΝΒΤ，再重新置于37 °C, 5 % CO2培养箱中培养30 min后，取出3~5X IO5个细胞，离心后加入DMSO混匀，酶标仪OD 570nm处检测各孔的吸光值。每个浓度设置三个重复组。[0036] 试验结果:结果显 示随着DHM处理剂量的增加，各组细胞的分化程度依次增高。说明DHM可有效诱导低分化的白血病细胞进行进一步的分化，从而达到治疗白血病的目的(图 8)。
【权利要求】
1.一种二氢杨梅素在促进失去正常分化能力的白血病细胞继续分化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的白血病细胞继续分化表现为提高CDll和CD14的表达量。
3.根据权利要求1所述的内容，其特征在于所述的白血病细胞继续分化表现为二氢杨梅素可以增强白 血病细胞中的磷酸已糖旁路代谢活动，加速葡萄糖-6-磷酸的氧化脱氢。
【文档编号】A61P35/02GK103933026SQ201310440537
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】朱润芝, 李明意, 夏娟, 刘洁, 张庆余, 刘斌 申请人:广东医学院附属医院