一种真菌发酵产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法。
【背景技术】
[0002] 6-羟基蜂蜜曲菌素（(R)-6_Hydroxymellein)，重要的天然产物，是具有抗菌作用 的植物抗毒素一一6-甲氧基蜂蜜曲菌素中间前体物质；也是具有抗菌、抗增殖、抗氧化作 用的天然产物土曲霉酮（Terrein)生物合成过程中重要的前体化合物。该物质主要从植 物、昆虫（美国蟑螂）、微生物代谢产物中分离得到。6-羟基蜂蜜曲菌素结构如下，分子式： Ci〇H1Q04,分子量为 194。
[0003]
[0004] 目前6-甲氧基蜂蜜曲菌素原料紧缺，急需寻求生产6-甲氧基蜂蜜曲菌素原料，可 为工业化合成提供原料。
【发明内容】
[0005] 本发明是要解决目前6-甲氧基蜂蜜曲菌素原料紧缺的问题，提供一种真菌发酵 产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法。
[0006] 本发明真菌发酵产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法，按以下步骤进行：
[0007] -、尖孢镰刀菌RE5的活化：将尖孢镰刀菌RE5接种于马铃薯固体培养基平板上， 放置于28°C恒温箱中，培养2~3d，备用；
[0008] 二、尖孢镰刀菌RE5种子液的制备：在无菌条件下，用接种环挑取活化后的尖孢镰 刀菌RE5的菌丝，接种于含有50mL马铃薯液体培养基的IOOmL锥形瓶中，于28°C，120r/min 条件下摇床培养2~3d，计数，得到种子液；
[0009] 三、尖孢镰刀菌RE5发酵液的制备：取尖孢镰刀菌RE5种子液，以5%的接种量接 种至含300mL马铃薯液体培养基的500mL锥形瓶中，共发酵20L，于28°C，120r/min摇床发 酵培养12~16d后，取出，真空抽滤，去除菌丝体，得RE5菌株发酵液，对RE5菌株发酵液进 行色谱分离，即得到6-羟基蜂蜜曲菌素。
[0010] 本发明获得的RE5菌株发酵液即含有6-羟基蜂蜜曲菌素。
[0011] 步骤一中马铃薯固体培养基（PDA)的配制：去皮马铃薯块200g，放入沸水中煮 30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g，全部溶解后， 定容至100〇1111^，121°(^高压灭菌3〇111；[11，冷却备用。
[0012] 步骤二中马铃薯液体培养基（PDA)的配制：去皮马铃薯块200g，放入沸水中煮 30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后，定容至lOOOmL，121°C高压 灭菌30min，冷却备用。
[0013] 步骤二中获得的种子液的浓度为IX107CFU/mL。
[0014] 所述尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum)RE5已于中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为CCTCCNo:M2012046,保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为：2012年2月 29臼。
[0015] 本发明采用尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum)RE5进行发酵，对其发酵液进行提 取分离，得到6-羟基蜂蜜曲菌素，6-羟基蜂蜜曲菌素的产量可达到3. 93~6mg/L。形成成 熟的技术路线后将进行工厂化生产，为工业化合成6-甲氧基蜂蜜曲菌素提供原料，以解决 6-甲氧基蜂蜜曲菌素原料紧缺的问题。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例1的结晶物的TLC实验结果；
[0017] 图2为实施例1的结晶物的结晶形态照片；
[0018] 图3为实施例1的结晶物的HPLC色谱图；
[0019] 图4为实施例1的结晶物的红外图谱；
[0020] 图5为实施例1的结晶物的1H-NMR图谱；
[0021] 图6为实施例1的结晶物的13C-NMR图谱；
[0022] 图7为实施例1的结晶物的LC-MS图谱。
【具体实施方式】
[0023] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式真菌发酵产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法，按以下步骤 进行：
[0025] -、尖孢镰刀菌RE5的活化：将尖孢镰刀菌RE5接种于马铃薯固体培养基平板上， 放置于28°C恒温箱中，培养2~3d，备用；
[0026] 二、尖孢镰刀菌RE5种子液的制备：在无菌条件下，用接种环挑取活化后的尖孢镰 刀菌RE5的菌丝，接种于50mL马铃薯液体培养基中，于28°C，120r/min条件下摇床培养2~ 3d，计数，得到种子液；
[0027] 三、尖孢镰刀菌RE5发酵液的制备：取尖孢镰刀菌RE5种子液，以5%的接种量接 种至300mL马铃薯液体培养基中，共接种发酵20L，于28°C，120r/min摇床发酵培养12~ 16d后，取出，真空抽滤，去除菌丝体，得RE5菌株发酵液，对RE5菌株发酵液进行色谱分离， 即得到6-羟基蜂蜜曲菌素。
[0028] 所述尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum)RE5已于中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为CCTCCNo:M2012046,保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为：2012年2月 29臼。
[0029]
【具体实施方式】二：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：步骤一中马铃薯固 体培养基的配制方法：去皮马铃薯块200g，放入沸水中煮30min，以8层纱布过滤，向滤液 中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g，全部溶解后，定容至lOOOmL，121°C高压灭菌 30min，冷却备用。其它与【具体实施方式】一相同。
【具体实施方式】 [0030] 三：本实施方式与一或二不同的是：步骤一中培养 2. 5d。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0031] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：步骤二和步 骤三中马铃薯液体培养基的配制方法：去皮马铃薯块200g，放入沸水中煮30min，以8层纱 布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后，定容至lOOOmL，121°C高压灭菌30min，冷却 备用。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0032] 五：本实施方式与一至四之一不同的是：步骤二中于 28°C，120r/min条件下摇床培养2. 5d。其它与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0033] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：步骤二中获 得的种子液的浓度为IX107CFU/mL。其它与一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0034] 七：本实施方式与一至六之一不同的是：步骤三中于 28°C，120r/min摇床发酵培养14d。其它与一至六之一相同。
【具体实施方式】 [0035] 八：本实施方式与一至七之一不同的是：步骤三中对 RE5菌株发酵液进行色谱分离的方法具体为：将RE5菌株发酵液用D-101大孔吸附树脂分 离，得固体物，将固体物溶于甲醇后，进行硅胶柱色谱分离，以不同比例的石油醚-乙酸乙 酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，每IOmL收一馏分，当收集石油醚：乙酸乙酯梯度为15 : 5 的馏分时，得到6-羟基蜂蜜曲菌素。其它与一至七之一相同。
[0036] 为验证本发明的有益效果，进行以下试验：
[0037] 实施例1:
[0038] 本实施例真菌发酵产6-羟基蜂蜜曲菌素的方法，按以下步骤进行：
[0039] -、尖孢镰刀菌RE5的活化：将尖孢镰刀菌RE5接种于马铃薯固体培养基平板上， 放置于28°C恒温箱中，培养3d，备用；
[0040] 二、尖孢镰刀菌RE5种子液的制备：在无菌条件下，用接种环挑取活化后的尖孢镰 刀菌RE5的菌丝，接种于含有50mL马铃薯液体培养基的IOOmL锥形瓶中，于28°C，120r/min 条件下摇床培养3d，计数，得到种子液；
[0041] 三、尖孢镰刀菌RE5发酵液的制备：取尖孢镰刀菌RE5种子液，以5%的接种量接 种至含300mL马铃薯液体培养基的500mL锥形瓶中，共发酵20L，于28°C，120r/min摇床发 酵培养14d后，取出，真空抽滤，去除菌丝体，得RE5菌株发酵液，作为供试品，备用。
[0042] 步骤一中马铃薯固体培养基（PDA)的配制：去皮马铃薯块200g，放入沸水中煮 30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g，全部溶解后， 定容至100〇1111^，121°