一种用于豹纹鳃棘鲈鉴别的引物对和探针、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提出了一种用于豹纹鳃棘鲈鉴别的引物对和探针、试剂盒及检测方法。所述引物对F289和R380，其序列分别为SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示的序列；所述探针P309的序列为SEQ?ID?No：3所示的序列，在探针序列的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA。本发明还保护了含有该引物对、探针的试剂盒及使用该引物对、探针或者试剂盒进行豹纹鳃棘鲈鉴别的方法，该方法具有快速、准确且灵敏的优点。
【专利说明】一种用于豹纹鳃棘鲈鉴别的引物对和探针、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋生物【技术领域】，尤其涉及用于豹纹鳃棘鲈鉴别的引物对和探针、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]物种鉴定是关系食品安全、质量、品质和营养等诸多方面的重要问题。物种来源不明的食品有可能因为含有过敏原成分和有毒成分而带给消费者巨大的食品安全风险。另外，由于不同鱼种的价值差异，用廉价鱼种非法替代重要经济价值鱼种的现象越来越严重。一些不法商贩频频通过错误标签、以次充好和虚假标注等手段牟取暴利，损害消费者的利益和健康，使得鱼类食品的质量安全问题逐渐凸现。欧洲委员会第104/2000条例和我国《预包装食品标签通则》都要求产品标识真实属性的专用名称，FDA “水产品危害及控制指南”第四版(2011)要求水产品标签必须使用FDA可接受销售鱼种名录中的名称。因此，准确、快速地鉴别鱼类物种显得尤为重要。
[0003]鱼类的物种鉴定，已从传统的形态学方法发展到目前广泛应用的分子生物学方法。传统的形态学方法局限性多，对于加工过的鱼片、鱼糜产品并不适用。分子生物学技术以其简便、快速的特点，发展迅速。其中，实时荧光PCR技术由于具有特异性高、不需要PCR产物后处理、有效解决了 PCR污染问题、自动化程度高等优点，已成为国内外基因研究的热点。
[0004]豹纹觸棘S卢{Plectropomus又称东星斑,属于福鳍鱼纲S卢形目S卢亚目鯧科，分布于西太平洋区，包括日本南部、台湾、澳大利亚、斐济等海域，是名贵的海洋经济鱼类，在中国和世界的市场需求量很大，价格昂贵。近年来随着人们生活水平的提高和需求的不断变化，东星斑的消费发展极为迅猛，时有用低廉鱼类冒充东星斑的现象发生，扰乱了东星斑的贸易市场。但是，国内外学者对豹纹鳃棘鲈进行物种DNA鉴定的研究很少，国内外尚未见报道能够快速鉴别豹纹鳃棘鲈的方法。
[0005]因此，本领域急需一种快速、简单、特异地鉴别豹纹鳃棘鲈的方法来增强名贵石斑鱼市场的技术监管，保障水产品市场的规范秩序。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种能够快速、准确且灵敏地进行豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法。
[0007]为实现上述目的，本发明提供一种用于实时荧光PCR方法鉴别豹纹鳃棘鲈的引物对和探针，其特征在于，所述引物对F289和R380，其序列分别为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所不的序列，所述探针P309的序列为SEQ ID No:3所不的序列，在探针序列的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA。
[0008]一种用于实时荧光PCR方法鉴别豹纹鳃棘鲈的试剂盒，其特征在于:含有权利要求I所述引物对和探针的试剂盒。
[0009]所述引物对和探针、所述试剂盒用于鉴别豹纹鳃棘鲈的用途。
[0010]用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，其特征在于:包括用权利要求1的引物对和探针，或者权利要求2试剂盒中的引物对和探针进行实时荧光PCR扩增的步骤。
[0011]所述引物对和探针用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于: 从样品中提取DNA为I旲板；
利用权利要求1的引物对和探针，或者权利要求2试剂盒中的引物对和探针，进行实时荧光PCR扩增；
对扩增曲线进行分析，并作出判断。
[0012]所述的实时荧光PCR扩增反应体系为25 μ L，即在0.2 mL的PCR反应管中加入
12.5 μ L 2XPCR Taqman 实时荧光PCR预混液，I μ L 10 μ mol/L 的上游引物F289，I μ L10 μ mol/L的下游引物R380，I μ L 10 μ mol/L的探针Ρ309，5 μ L样品基因组DNA，4.5μ L双蒸水。
[0013]所述的实时荧光PCR扩增反应条件为:95 V 10 min ；95 V 15 s，64 V 35 s，共35个循环。
[0014]所述的结果分析并作出判断是样品出现典型的特异性扩增曲线且Ct值小于35即判断为检出豹纹鳃棘鲈 。
[0015]本发明引物对和探针是通过分析已报道的豹纹鳃棘鲈线粒体细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidase subunit I，C0I)基因序列设计。
[0016]本发明的引物对和探针根据豹纹鳃棘鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750763)和其他石斑鱼 COI 序列(Genbank 序列号 JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750764、JF750765)设计得到。
[0017]使用本发明的引物对和探针，利用实时荧光PCR方法能够特异、灵敏地检测出豹纹觸棘鲈。
[0018]使用本发明的引物对和探针进行实时荧光PCR检测，实施例显示，只有豹纹鳃棘鲈有特异性扩增曲线，其他50种其他鱼类(赤点石斑、云纹石斑、棕点石斑、点带石斑、青石斑、玳瑁石斑、宽额鲈、斑鳃棘鲈、驼背鲈、二长棘鲷、黑鳍髭鲷、条石鲷、黄鳍鲷、黑鲷、横带髭鲷、真鲷、花尾胡椒鲷、长尾大眼鲷、圆头平鲷、摩拉吧笛鲷、花鲈、大西洋红鲈、大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼、曲纹唇鱼、多宝鱼、竹荚鱼、褐鲳鈾、长印鱼、四指马鲅、缘金线鱼、长棘银鲈、齿颌眶棘鲈、三线矶鲈、条纹鲽、棕斑蓝子鱼、短棘鲳、银鲳、金鲳、乌鲳、棘鲳、日本单鳍电鳐、孔鳐、尖嘴魟、条纹斑竹鲨、三文鱼、大口黑鲈、乌鳢、锦鲤)均无特异性扩增。结果表明建立的实时荧光PCR方法具有良好的特异性，可用于豹纹鳃棘鲈的检测。
[0019]使用本发明的引物对和探针进行实时荧光PCR检测，可从豹纹鳃棘鲈含量为0.05%的样品中成功检测出豹纹鳃棘鲈。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。
[0020]使用本发明的引物对和探针进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点；本发明的实时荧光PCR检测方法，具有高效、快速和敏感性高的优点。
[0021]使用本发明的引物对进行检测，其快速、特异、灵敏、准确和简便的特点适合用于国内外市场上豹纹鳃棘鲈的真伪鉴别和样品中豹纹鳃棘鲈成分的检测等。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明豹纹鳃棘鲈实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果图；
图2为本发明豹纹鳃棘鲈实时荧光PCR检测方法的灵敏度试验结果图。
【具体实施方式】
[0023]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0024]实施例1:引物、探针和试剂盒的制备
1.引物对和探针的设计:根据豹纹鳃棘鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750763)和其他石斑鱼COI序列设计并合成。具体引物对序列如下:
SEQ ID No:1:5’ - GCTTCTACCTCCTTCTTTCCTC -3，
SEQ ID No:2:5， - CTGCTAGAGGAGGGTAAACTG -3，
探针序列如下:
SEQ ID No:3:5’ - TCCTCCTTCTAGCCTCATCAGGCGTT -3’ ；
在探针的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA ；
2.引物对和探针的合成和试 剂盒的制备:
根据上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物对和探针。
[0025]将上述合成好的引物对和探针分别配制成浓度为10 Mfflol/L的溶液作为试剂盒，备用。
[0026]以下实施例所述的上游引物F289即为SEQ ID No:1，下游引物R380即为SEQ IDNo:2，探针P309的序列即为SEQ ID No:3。
[0027]实施例2:实时荧光PCR扩增检测
1.样品基因组DNA的提取(按照QIAGEN DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒制备样品的基因组DNA溶液):
1)取鱼的肌肉组织剪碎后，用液氮充分研磨混匀。从中取约25mg置于灭菌的1.5 mL离心管中；
2)加入180μ? ATL缓冲液和20 PL蛋白酶K，漩涡混匀，56 °C水浴约I h，并不断摇动，直至组织完全消化；
3)加入200μ? AL缓冲液，漩涡混匀。再加入200 μ?无水乙醇，再次混匀；
4)将离心管中的溶液转移至置于2mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12000 rpm离心I min，弃去收集管和管中的离心液体；
5)将spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 ? AWl缓冲液(试剂盒所带)，12 000 rpm离心I min，弃去收集管和管中的离心液体；
6)将spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 ? AW2缓冲液(试剂盒所带)，12 000 rpm离心3 min，弃去收集管和管中的离心液体；7)将spincolumn柱置于新的1.5 mL离心管中，加入100 ? 65 °C预热的AE缓冲液(试剂盒所带)溶解DNA，室温静置2 min ；
8)12 000 rpm离心2 min。离心管中的液体即为提取的样品基因组DNA溶液。检测DNA浓度及质量，-20 1:保存备用；
2.实时荧光PCR扩增:
O实时荧光PCR反应体系和反应条件
以步骤I提取的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR反应；
实时荧光PCR反应体系为25 μ L，即在0.2 mL的PCR反应管中加入12.5 μ L 2XPCRTaqman实时突光PCR预混液[Taqman 2Χ Fast Start Universal Probe Master Mix (Rox)(Roch Applied Science) ], I μ L 10 μ mol/L 的上游引物F289,1 μ L 10 μ mol/L 的下游引物 R380，l μ L 10 ymol/L 的探针 Ρ309，5 yL 样品基因组 DNA (5-50 ng/μ? , 4.5 μ L双蒸水；
将样品管放入Stratagene Μχ3005Ρ实时荧光定量PCR仪(美国Agilent公司)，设置反应条件为:95 V 10 min ；95 V 15 S，64 V 35 S，共 35 个循环；
2)实时荧光PCR扩增的结果分析和判断
如果样品Ct值小于35且有典型的特异性扩增曲线则为阳性，即样品检出豹纹鳃棘
鱼卢;
3)用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR方法的特异性确定
实验中所有鱼样品均来自水产品批发市场。取豹纹鳃棘鲈和50种其他鱼类(赤点石斑、云纹石斑、棕点石斑、点带石斑、青石斑、玳瑁石斑、宽额鲈、斑鳃棘鲈、驼背鲈、二长棘鲷、黑鳍髭鲷、条石鲷、黄鳍鲷、黑鲷、横带髭鲷、真鲷、花尾胡椒鲷、长尾大眼鲷、圆头平鲷、摩拉吧笛鲷、花鲈、大西洋红鲈、大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼、曲纹唇鱼、多宝鱼、竹荚鱼、褐鲳鈾、长印鱼、四指马鲅、缘金线鱼、长棘银鲈、齿颌眶棘鲈、三线矶鲈、条纹鲽、棕斑蓝子鱼、短棘鲳、银鲳、金鲳、乌鲳、棘鲳、日本单鳍电鳐、孔鳐、尖嘴魟、条纹斑竹鲨、三文鱼、大口黑鲈、乌鳢、锦鲤)，按上述方法分别提取基因组DNA，并进行实时荧光PCR扩增。结果如图1所示，只有豹纹鳃棘鲈出现典型的扩增曲线，Ct值为17，其他50种鱼和空白对照(ddH20)均未出现扩增曲线。充分说明本实验建立的实时荧光PCR方法对豹纹鳃棘鲈表现出较好的特异性；
4)用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR方法的灵敏度确定
将豹纹鳃棘鲈的鱼肉组织与花鲈的鱼肉组织混合，配制成豹纹鳃棘鲈相对百分含量(w/w)为10 %、5%、1 %、0.5%、0.1 %、0.05%、0.01 %和0%的鱼类组织样品，按上述方法分别提取基因组DNA，进行实时荧光PCR扩增。检测结果如图2所示。图2中编号I一9荧光曲线对应的样品依次为豹纹鳃棘鲈相对百分含量100%、10 %、5%、1 %、0.5%、0.1 %、0.05%、
0.01%、0%的鱼肉样品。实验结果显示:豹纹鳃棘鲈含量分别为100%、10 %、5%、1 %、0.5%、
0.1 %、0.05%的鱼肉样品Ct值小于30，有特异性扩增曲线，而豹纹鳃棘鲈含量为0.01%的鱼肉样品，超过34个循环才有微弱扩增，可以忽略不计。结果表明建立的实时荧光PCR方法可从豹纹鳃棘鲈含量为0.05 %的鱼肉样品中成功检测出豹纹鳃棘鲈。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。
[0028]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种用于实时荧光PCR方法鉴别豹纹鳃棘鲈的引物对和探针，其特征在于，所述引物对F289和R380，其序列分别为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的序列，所述探针P309的序列为SEQ ID No:3所示的序列，在探针序列的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA。
2.一种用于实时荧光PCR方法鉴别豹纹鳃棘鲈的试剂盒，其特征在于:含有权利要求1所述引物对和探针的试剂盒。
3.权利要求1的引物对和探针、权利要求2的试剂盒用于鉴别豹纹鳃棘鲈的用途。
4.用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，其特征在于:包括用权利要求1的引物对和探针，或者权利要求2试剂盒中的引物对和探针进行实时荧光PCR扩增的步骤。
5.权利要求4所述的用于豹纹鳃棘鲈鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于: 从样品中提取DNA为I旲板； 利用权利要求1的引物对和探针，或者权利要求2试剂盒中的引物对和探针，进行实时荧光PCR扩增； 对扩增曲线进行分析，并作出判断。
6.权利要求4或5所述方法，其特征在于:所述的实时荧光PCR扩增反应体系为25μ L，即在0.2 mL的PCR反应管中加入12.5 μ L 2 X PCR Taqman实时荧光PCR预混液，IUL 10 ymol/L 的上游引物 F289，l μ L 10 μ mol/L 的下游引物 R380，I μ L 10 μ mol/L的探针Ρ309，5 μ L样品基因组DNA，4.5 μ L双蒸水。
7.权利 要求4或5所述方法，其特征在于:所述的实时荧光PCR扩增反应条件为:950C 10 min ；95 °C 15 s，64 °C 35 s，共 35 个循环。
8.权利要求4或5所述方法，其特征在于:所述的结果分析并作出判断是样品出现典型的特异性扩增曲线且Ct值小于35即判断为检出豹纹鳃棘鲈。
【文档编号】C12N15/11GK103589802SQ201310585155
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】陈双雅, 张永祥, 李宏, 王嘉鹤, 陈伟玲, 周昱 申请人:陈双雅