一种甲基化dna检测的新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及医学和分子生物学技术，即一种甲基化DNA检测的新方法。
【背景技术】
[0002]近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提不相应样品中癌细胞的存在。
[0003]甲基化DNA是在DNA链的C残基上修饰有一个甲基。人类异常的DNA甲基化多发生在基因的转录调控区，引起相应基因转录的关闭，使基因丧失功能。多种癌症的发生与DNA异常甲基化有关，通过对DNA甲基化的检测，可以提供体内是否存在癌细胞的信息。
目前，对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种甲基化DNA检测的新方法，其目的在于提高检测样品中的甲基化DNA的灵敏度和检测的稳定性提供一种新方法。
[0005]为了解决上述问题，本发提供的一种甲基化DNA检测的新方法采用了如下的技术方案:
本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提尚甲基化DNA的检测灵敏度。
[0006]一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于:
第一步:筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；
第二步:从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；
第三步:配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，Taq DNA聚合酶； 第四步:加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；
第五步:步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；
第六步:用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；
第七步:以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；
第八步:将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。
[0007]优选的，所述的第一步中一组12个基因，具体如下:SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SP0CK2、TLX2、HLTF、HPP1。
[0008]优选的，所述第四步中PCR反应条件是:预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。
[0009]优选的，所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。
[0010]优选的，所述绿豆核酸酶的反应条件是:lx绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。
[0011]优选的，所述第七步中PCR反应条件是:预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。
[0012]本发明的有益效果是:本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使设计的引物不仅保证PCR产物的长度呈梯度分布，各PCR产物的退火温度保持接近，实现多重PCR条件下的非甲基化DNA的PCR产物在特定温度下的部分变性，从而可以被单链DNA特异性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高，通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性，多重PCR 一次性检测多个甲基化基因，提尚检测效率，提尚检测的灵敏度和检测的稳定性。
【附图说明】
[0013]图1人通用甲基化DNA和非甲基化DNA标准品的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迀移时间图。
[0014]图2大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测实例。
【具体实施方式】
[0015]为了更清楚的理解本发明提供的技术方案，下面结合具体的实施例对技术方案做进一步的说明。
实施例
[0016]近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。
[0017]本发明的实施例的技术方案是:
第一步:筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化