抗性基因
[0027]I，利用CTAB法提取番茄基因组DNA
[0028]待鉴定材料为以下品种的番茄材料:申粉8号、申粉918、浦红9号、浦红10号、申粉V-1、东农721、先正红珠。
[0029]采集上述品种番茄材料的新叶，用CTAB法提取DNA，具体提取方法如下:
[0030](I)取l_50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。(2)将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v) 2 X CTAB提取缓冲液，65°C保温10-20分钟，其间不时摇动。(3)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10-20分钟。(4)将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min离心10分钟。(5)将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置30分钟。(6) 3500-4000r/min离心5-10分钟，去上清液，70%乙醇漂洗，沉淀吹干。(7)风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA，-20°C保存备用。
[0031]2，用分子标记引物对番茄DNA进行PCR扩增
[0032]用筛选的分子标记引物对前述提取的番茄基因组DNA进行PCR扩增，所述分子标记引物的正向引物序列为5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，所述分子标记引物的反向引物序列为5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)ο
[0033]PCR的反应体系是:10ng/uL的模板DNA 3 μ L，10umol/L的正向引物2.5 μ L，10umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L，1mmoI/L 的 Mg2+2.5ul，Taq 酶 1U，补充 ddH20 至 25 μ L ;
[0034]PCR程序分别为:94 °C预变性3min，然后94°C变性30s，退火温度57 °C 60s，72°C 60s，进行35个循环，最后72°C延伸1min。
[0035]3，对PCR扩增产物进行电泳分析
[0036]将前述PCR扩增产物于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳。参见图1，该图为本发明中的分子标记引物对待检测番茄材料进行PCR扩增后产物的电泳图。图1中M代表的泳道为TaKaRa DL1000DNA Marker ；1代表的泳道为空白对照H2O ；2代表的泳道为申粉8号的番茄材料；3代表的泳道为申粉918的番茄材料；4代表的泳道为浦红9号的番茄材料；5代表的泳道为浦红10号的番茄材料；6代表的泳道为申粉V-1的番茄材料；7代表的泳道为东农721的番茄材料；8代表的泳道为先正红珠的番茄材料。其中泳道6出现690bp条带，表明对应的番茄材料申粉V-1为抗病番茄品种；其它泳道均出现409bp的条带，表明其它番茄材料均为不抗病番茄品种。
[0037]上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
【主权项】
1.一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法，该方法包括如下步骤: 步骤I，提取番茄的基因组DNA ； 步骤2，用分子标记引物对前述提取的番茄基因组DNA进行PCR扩增，所述分子标记引物的正向引物序列为5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’，所述分子标记引物的反向引物序列为 5， -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3，； 步骤3，对前述PCR扩增产物进行电泳分析，如果电泳图中产生690bp的条带，则表明植株中含有黄化曲叶病毒抗性基因Ty-Ι，为抗病植株；如果电泳图中产生409bp的条带，则表明植株为含ty-Ι基因位点的株系，为不抗病植株。
2.如权利要求1所述的鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法，其特征在于:所述步骤3中PCR扩增产物的电泳图中如果同时产生690bp和409bp的条带，表明植株为含Ty-1/ty-l位点的株系，为杂抗植株。
3.如权利要求1所述的鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增的反应条件如下: PCR的反应体系是:10ng/uL的模板DNA 3yL，10umol/L的正向引物2.5 μ L，1umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，1XPCR buffer2.5 μ L，10mmol/L 的Mg2+2.5ul，Taq 酶 IU，补充 ddH20 至 25 μ L ; PCR程序分别为:94°C预变性3min，然后94°C变性30s，退火温度57°C 60s, 72°C 60s，进行35个循环，最后72°C延伸1min。
4.一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记引物，其特征在于:该引物的正向引物序列为5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’，反向引物序列为5， -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3，。
5.权利要求4所述的分子标记引物在番茄黄化曲叶病毒抗性基因定位、检测或标记辅助育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法。该方法为：提取番茄的基因组DNA；用分子标记引物对前述提取的番茄基因组DNA进行PCR扩增，对前述PCR扩增产物进行电泳分析，如果电泳图中产生690bp的条带，则表明植株中含有黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1，为抗病植株；如果电泳图中产生409bp的条带，则表明植株为含ty-1基因位点的株系，为不抗病植株。本发明标记方法中的电泳图带型简单，易于鉴别，可直接应用于标记辅助选择，节省了时间、物力、人力，且提高鉴定的准确性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104726602
【申请号】CN201510160949
【发明人】刘士辉, 张辉, 朱为民, 姚永康, 马新海, 金静, 孙洪助, 阎君, 刘娜, 于力, 杨学东
【申请人】上海孙桥现代农业联合发展有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月7日