与哮喘发病危险度相关的snp标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用，具体地，本发明涉及与哮喘发病危险度相关的SNP 标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记在制备哮喘发病危险度诊断 试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 支气管哮喘（简称哮喘）是一种以气道慢性非特异性炎症（chronic away inflammation)和气道重塑（away remodeling)为两大特征的常见病和多发病。据估计 全球有10%人口罹患哮喘，其耗费占总卫生保健支出的1%~2%。近年来，无论是在发 达还是发展中国家，哮喘的发病率和病死率都呈逐年快速上升趋势，哮喘已成为严重的全 球公共卫生问题。目前对哮喘的病因及发病机制还不十分清楚。多年来国内外学者从不 同角度探讨哮喘的发生发展机理，从分子遗传学角度来看，哮喘是多基因参与的具有遗传 易感性的一组临床综合症，其遗传率高达36%~79%，基因一基因、基因一环境交互作用 的影响使得一部分人存在哮喘易感性，但是其确切的遗传模式还不清楚。通过定位克隆 (positional cloning)和候选基因关联石开宄（candidate gene association study)等方 法，已经发现许多哮喘易感基因，个体患病的风险不同可以理解为由于DNA序列变异造成 的一遗传素质Il的差异使然。随着后基因组时代已经到来，第三代遗传标记单核苷酸多态 性（single nucleotide polymorphism, SNP)成为研宄新热点，SNP对哮喘易感性和表型的 影响的研宄对哮喘发病机制的揭示以及哮喘个体化治疗将有重要意义。
[0003] Toll样受体（Toll like receptor, TLR)属于模式识别受体家族 (pattern-recognition receptors, PRR)，主要识别环境中的各种微生物，从而在人体的天 然免疫和获得性免疫中发挥极其重要的作用，控制着树突状细胞（DC)的成熟和Th细胞的 分化，因此与变应性疾病包括哮喘的关系十分密切。目前为止，已有13种TLR在哺乳动物 发现和鉴定，而人则有前10种。TLR主要表达于DC，不同亚型的TLR分别或协同识别不同 的配体，如TLR2分别与TLRl或TLR6形成异源二具体识别脂蛋白和脂肽等、TLR3识别病 毒双链RNA(dsRNA)、TLR4识别革兰氏阴性杆菌脂多糖（LPS)、TLR7和TLR8识别病毒单链 RNA(ssRNA)、TLR9识别未甲基化CpG DNA。这些TLR有相似的信号转导途径，但又不尽相 同，主要通过一系列衔接分子的磷酸化与脱磷酸化，激活核因子-κ B (NF- κ B)、促分裂原活 化蛋白激酶（MPK)和干扰素调节因子家族，引起一系列免疫应答，从而保护宿主免受微生 物的侵害并影响ThO分化，进而影响过敏性疾病包括哮喘的发生发展。
[0004] 动物实验证实激活TLR9不仅可以降低哮喘小鼠的气道嗜酸性粒细胞、支气管肺 泡灌洗液（BALF)中IL-4、IL-5、IgE的水平，还可以抑制气道重塑。一些人工合成的TLR9 激动剂能够有效的降低Th2应答而增加 Thl和调节性T细胞因子的水平，并且在临床上显 示出对过敏性疾病包括哮喘有显著的疗效。因此TLR9与哮喘密切相关，TLR9基因可能是 哮喘易感基因之一。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，通过检测与支气管哮喘相关的SNP位点，检测和 分析受检人是含有哮喘保护因子还是属于哮喘易发人群，将哮喘易发人群筛选出来，提前 告知采取相应的预防措施，达到预防为主，防治结合的目的。
[0006] 发明人通过对462例哮喘患者及398例健康人群的深入研宄，发现了 TLR9的SNP 位点rs352140和哮喘发病危险度密切相关，和哮喘相关表型FEVl %、FEV1/FVC、IgE水平以 及哮喘严重程度亦相关，并据此开发了能够判断哮喘发病危险度的试剂盒。
[0007] 本发明的目的在于提供一个和哮喘发病危险度密切相关的SNP位点rs352140,所 述SNP位点为纯合子TT的个体哮喘发病危险度要远远低于基因型为纯合子CC或杂合子CT 的个体。
[0008] 本发明的目的还在于提供了用于检测SNP位点基因型的检测试剂，所述检测试剂 可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs352140 位点的基因型即可。
[0009] 进一步，本领域技术人员已知，检测单核苷酸多态性的方法很多，可分为杂交法、 熔解法、电泳法、测序法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法。以杂交法检测SNP 的有位点特异寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，简称ASO)、焚光共振能量 转换（fluorescence resonance energy transfer，简称 FRET)、金纳米颗粒探针等；以溶 解法检测SNP的有动力学位点特异性杂交（dynamic allele-specific hybridization， 简称DASH)、DNA熔解分析、变性高效液相色谱法等；以电泳法检测SNP的有SSCP单链构 象多态性（single strand conformation polymorphism)、DGGE/TGGE 变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis)、杂合双链分析等；以酶学法检测SNP的有 ARM扩增不应突变系统（amplification refractory mutation system)、SNuPE单核苷酸引 物延伸（single nucleotide primer extension)、SNaPshot 法、TaqMan ASO (5' nuclease assays)、0LA 寡核苷酸连接分析（oligonucleotide ligation assay)、CFLP 裂解片段长度 多态性（cleavase fragment length polymorphism)、EMC错配的酶裂解（enzyme mismatch cleavage)、RNA:DNA 错配分析、BESS 喊基切除的序列扫描（base excision sequence scanning)、NIRCA 非同位素 RNA 酶裂解分析（nonisotopic rnase-cleavage assay)、寡核 苷酸探针的侵略性裂解（invasive cleavage of oligonucleotide probes)、扣锁探针、 分子反转探针（molecular inversion probe，简称 MIP)、GBA 遗传单位分析（genetic bit analysis)、CAPS 裂解扩增多态性序列分析（cleaved amplified polymorphic sequence analysis)、PTT 蛋白质残缺检测（protein truncation test)、READIT 反向酶活性 DNA 查 询（reversed enzyme activity DNA interrogation test)、DNA测序等；用化学法检测 SNP 的有错配的化学裂解（chemical cleavage of mismatch)、铭嵌入法、高猛酸钾法、离子敏 场效应晶体管等；用物理法检测SNP的有基质辅助的激光吸附/离子化飞行时间质谱分析 (MALDI-T0F MS)、G00D ASSAY等。其中，SNaPshot技术由美国应用生物公司（ABI)开发，它 的原理：先经过多重PCR，将模版体外扩增。然后用虾碱酶消化掉剩余的dNTP。在一个含有 测序酶、4种荧光标记的ddNTP(不含dNTP)，以及紧挨多态位点5'端的不同长度延伸引物 和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。4种双脱氧核苷酸--ddATP、 ddTTP、ddCTP和ddGTP分别加上荧光标记dR6G、dR0XTM、dTAMRA?和dR110,经ABI荧光测序 仪检测并由Peak scaner等软件分析后，分别呈现出绿、红、黑、蓝等4种颜色。因此，根据 峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型；根据峰的位置和延伸引物设计 方案，可以确定该峰所对应的SNP位点。
[0010] 本发明的目的还在于提供的用于检测SNP位点基因型的检测试剂，所述检测试剂 检测rs352140位点是否是TT基因型。进一步的，检测试剂包括用于扩增SNP位点在内的 核苷酸序列的引物、能够检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。
[0011] 本发明的目的在于提供一种检测哮喘发病危险度的引物，所述引物可以 扩增rs352140位点在内的核苷酸序列，引物序列如下：正向引物SEQ ID NO 1 : 5' -CTGCAGAGCTGCTGGGACACTT-3' ；反向引物 SEQ ID NO 2 :5' -CTGACCGGTCTGCAGGTGCT-3' ； 所述单碱基延伸引物序列为：SEQ ID NO 3:5'-TTTTTTTTTTTTTTTGCAMTCATTCACGGAGCTA CC-3'。
[0012] 本发明的目的还在于提供了用于检测SNP位点基因型的试剂盒，该试剂盒包括采 用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs352140位点的基 因型。优选的，所述的试剂盒包括检测rs352140位点是否是TT基因型的检测试剂。
[0013] 进一步，所述的用于检测SNP位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的 核苷酸序列的引物、能够检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs352140位点 在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物SEQ ID NO 1;反向引物SEQ ID NO 2;所述 单碱基延伸引物序列为：SEQ ID NO 3。
[0014] 本发明提供了用于判断个体哮喘发病危险度的检测试剂盒，该试剂盒的判断原理 是利用试剂盒中的试剂检测rs352140位点的基因型，根据所测个体的上述SNP位点的基因 型判断其哮喘发病危险度。当rs352140位点基因型为纯合CC或杂合CT时，被测个体属于 哮喘发病危险度高的人群，当rs352140位点基因型为纯合TT时，被测个体属于哮喘发病危 险度低的人群。
[0015] 本发明还提供了 rs352140位点在制备一种判断哮喘发病危险度的检测试剂中的 应用。所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能 够检测样本中rs352140位点的基因型即可。优选采用正向引物SEQ ID NO 1;反向引物SEQ ID NO 2;所述单碱基延伸引物序列为：SEQ ID NO 3检测样本中rs352140位点的基因型。
[0016] 本发明还提供了 rs352140位点在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。所 述试剂盒中包括能够检测SNP位点基因型的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂包 括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够检测SNP位点基因型的单碱基延 伸引物。用于