的候选基因，本发明发明人利用日本晴的参考序列，通过2 种基因预测软件 RiceGAAS(http://ricegaas. dna.affrc.go.jp)和 Softberry 的 FGENESH(http://www. softberry. com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析确 定。在日本晴中，Pi50区域的候选抗性基因为7个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复 (nucleotide binding site-leucine-rich repeat，NBS_LRR)的候选基因（Pi501_NP， Pi502-NP， Pi503-NP， Pi504-NP， Pi505-NP， Pi506-NP 和 Pi507-NP)，其中 Pi501-NP 和 Pi507-NP在已报道的Pi2/9家族所持各品种中高度保守，几乎没有差异。而基于基因的完 整性以及特异性标记的存在/缺失（presence/absence，P/A)分析结果表明，其余5个在品 种间存在差异的候选基因（Pi502-NP，Pi503-NP，Pi504-NP，Pi505-NP以及Pi506-NP)的结 构不完整。通过进一步比照Pi2/9簇基因的结构，本发明发明人发现日本晴在该区域存在 一个大约20kb的缺失（在Pi502-NP和Pi503-NP之间），而此缺失恰对应于Pi2/z-t的功 能成员。这可能可以解释相对于Pi2/9抗源品种，日本晴表现为感病的原因。类似地，Pi50 基因位点在EBZ基因组上存在的8-9个具有NBS-LRR保守结构的候选基因，对应于日本晴 的5个预测候选基因的结构也不完整。因此推断，Pi50的候选抗性基因可能就存在于感病 品种日本晴所缺失的那部分片段之中。
[0030] 进一步分析，在EBZ中存在，且在日本晴中缺失，具有完整的NBS-LRR保守结构及 并能够表达的基因，并依据其在基因簇中所处的位置，将其命名为Pi50-N4。其中Pi50-N4 在基因组上的序列长达7063bp，如SEQ ID NO. 3所示。
[0031] 二、获得 Pi50-N4 的 cDNA
[0032] 利用 RT-PCR技术，用 Superscript III Reverse Transcriptase 反转录酶 III (美 国invitrogen公司原装进口）和Oligo(dT) 18进行逆转录，逆转录的体系和反应条件按 Superscript III Reverse Transcriptase 反转录酶 III 说明书操作。
[0033] 再用如下引物进行PCR扩增：
[0034] 上游引物 F1 :5' -ATGGCGGAGACGGTGCTGAGC-3' ；
[0035] 下游引物 R1 :5' -TCAGCCAGCTTGAGCTGTGC-3'。
[0036] 得到的 Pi50-N4 的 cDNA 序列为 3099bp。
[0037] 三、序列的分析
[0038] 通过比较 Pi50-N4 基因组序列（SEQ ID N0. 3)和 cDNA 序列（SEQ ID N0. 1)，可 知，Pi50-N4基因组序列含有两个内含子，其第一外显子为第1~116位，第二外显子为 第3953~6904位，第三外显子为第7033~7063位。该基因的cDNA序列与Pi2/9簇 中已克隆的等位基因Pi2(序列见GenBank:DQ352453.1中的产物为"NBS-LRR type R protein，Nbs4_Pi"部分）和 Pi_zt 的 cDNA 序列（序列见 GenBank:DQ352〇40. 1)高度保守， 相似度达到98%以上，通过多重序列的比对可见，各基因间的差异主要集中在近3'端的第 一个LRR结构域中，Pi2和Pi-zt之间只有8个氨基酸的差异，这8个氨基酸的差异即造成 了两个基因抗性的差异（Zhou et al.，2006. The Eight Amino-Acid Differences Within Three Leucine-Rich Repeats Between Pi2and Piz_t Resistance Proteins Determine the Resistance Specificity to Magnaporthe grisea.MPMI, 19:1216 - 1228)，而在此区 域Pi50-N4 (编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）与前述两个基因又有10个氨基 酸的差异。
[0039] 实施例2 :水稻稻瘟病抗性基因Pi50的遗传互补实验及转化子的鉴定
[0040] 一、获得 Pi50-N4 基因
[0041] 以EBZ的基因组为模板，通过如下引物扩增得到Pi50-N4基因组基因：
[0042] 上游引物 F2 :5' -ACGAATTCGAGCTCGGTACC CTTGACATCCAAACCGCACC-3' ；
[0043] 下游引物 R2 :5 ' -AGTGCCAAGCTTCGGCGCGCC TCAGCCAGCTTGAGCTGTGC-3 '。
[0044] PCR反应体系为：高保真酶KOD plus neo 0. 4 y 1、EBZ基因组模板 1. 2 y l(100pg ~50ng)、DMS0 0? 5 y 1、引物 F2(10 yM)0. 6 y 1、引物 R2(10 yM)0. 6 y 1、 dNTP(2mM)4 y 1、2倍浓度的缓冲液（2Xbuffer) 10 y 1、双蒸水补足20 y 1。
[0045] PCR温度循环条件为：94°C 2分钟；98°C 10秒、56°C 30秒、68°C 9分钟，68°C的延 伸时间以每循环的延长10秒的梯度运行5个循环；98°C 10秒、68°C 10分钟，并以每循环 68°C延伸时间延长10秒的梯度运行32个循环；68°C延伸15分钟；12°C保存。
[0046] 得到的PCR产物用0. 8 %琼脂糖凝胶电泳，通过DNA凝胶回收试剂盒纯化得到 Pi50-N4基因组基因。电泳大致定量。
[0047] 二、表达载体的构建和转化
[0048] (1)载体线性化：用限制性内切酶Kpn I和Asc I双酶切pCAMBIA1300AscI载体 (按"刘新琼，等.稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因双元载体的构建.湖北农业科学，2007 年02期"中提供的方法制备得到）：酶切缓冲液（Cutsmart)2 y l、Kpn I和Asc I各0. 5 y 1、 Pi50-N4基因组基因3 y 1、双蒸水补足20 y 1 ;37°C酶切过夜；0. 8%琼脂糖凝胶电泳，回收， 电泳大致定量。
[0049] (2) In-Fusion反应：步骤（1)得到的Pi50-N4基因组基因350ng、线性化的 pCambial300AscI 载体200ng、5X In-Fusion HD 2 yl，双蒸水补足 10 yl。按 In-Fusion HD 克隆试剂盒的说明书操作，得到转化有重组载体pCambia-Pi50的大肠杆菌JM109菌株。
[0050] (3)扩大培养转化有重组载体pCambia-Pi50的大肠杆菌JM109菌株，抽提 pCambia-Pi50质粒，测序，可知往5'延伸的Pi50-N4基因组基因如SEQ ID NO. 4所示。
[0051] (4)按文献"Hiei，et al. 1994Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6:271 - 282. "方法，将pCambia-Pi50质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞， 再转化感病的水稻品种日Nipponbare(日本晴，通过国际水稻研宄所（http://www. irri. org)的国际共享种质资源库可免费获得）。用潮霉素B筛选，得到转化体。
[0052] 对得到的转化体进行鉴定：通过植物DNA提取试剂盒提取转化体（叶片）的基因 组DNA。利用基因内部近3'端的特异引物F3与载体克隆位点处的引物R3对转化体进行了 PCR检测。结果证明得到28个阳性转基因植株，另外有19个植株是转基因阴性植株，部分 转化体的鉴定电泳图如图3所示。
[0053] 上游引物 F3 :5 ' -GGTATATGGATAGCAGAAGG-3 ' ；
[0054] 下游引物 R3 :5 ' -GCGATTAAGITGGGTAACGC-3 '。
[0055] 用对Pi50无毒性的菌株TY19 (朱小源等，引致"天优998"抗性丧失的稻瘟病菌小 种鉴定及其致病性测定，广东农业科学，2008, 12:84-86)。对Pi50转基因株系及对照品种 进行苗瘟人工接种实验（按照"张磊，等.4套水稻稻瘟病鉴别品种对江苏地区主要稻瘟病 菌株的抗性分析.《江苏农业学报》，2010年05期"中提供的方法）。结果如表1和图4所 不〇
[0056] 表1遗传互补实验分析结果
[0057]
【主权项】
1. 一种稻瘟病抗性基因Pi50,其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pi50的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法，其特征在于能通过如下步骤得 到：通过化学合成方法得到；或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到。
3.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应用，其特征在于：将所述的稻瘟病抗性 基因Pi50用于选育对稻瘟病具有抗病性的水稻。
4.根据权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应用，其特征在于包括如下步骤：将 稻瘟病抗性基因Pi50转入易感病的水稻中，得到具有抗病性的水稻。
5.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。
【专利摘要】本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用。该稻瘟病抗性基因Pi50的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可通过化学合成方法得到该稻瘟病抗性基因Pi50；或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到该稻瘟病抗性基因Pi50。该稻瘟病抗性基因Pi50具有优异的抗病性，能用于选育对稻瘟病具有抗病性的水稻。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C07K14-415, C12N15-10, C12N15-82
【公开号】CN104845977
【申请号】CN201410822942
【发明人】苏菁, 朱小源, 陈深, 汪文娟, 汪聪颖, 曾列先, 杨健源
【申请人】广东省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年12月22日