一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法
【专利摘要】本发明提供一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法，该方法利用多位点序列分型技术，对PIF原料、半成品、成品及其加工环境的克罗诺杆菌进行分子分型研究，揭示其种群特征，明确克罗诺杆菌的系统发育关系，并通过生物信息学对克罗诺杆菌进行系统发育分析，从而系统的揭示上述环境中克罗诺杆菌的遗传特征；在克罗诺杆菌MLST分型的基础上，以该致病菌的ST和环境来源为变量进行相关性分析，确定PIF加工过程中最易污染克罗诺杆菌的关键环节和分布规律，从而追溯婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的来源。从而实现从根本上监控PIF生产过程，保证PIF质量的目的。
【专利说明】
一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品安全领域，追溯PIF中克罗诺杆菌的污染来源具体涉及一种婴儿 配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法。
【背景技术】
[0002] 克罗诺杆菌（Cronobacter spp·)是婴儿配方乳粉（powdered infant formula， PIF)中最具危害性的机会性致病菌之一，婴儿尤其是出生28天内的体重较轻的新生儿摄入 被克罗诺杆菌污染的PIF后，会导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等恶性疾 病，死亡率高达40%-80%。克罗诺杆菌是肠杆菌科中环境适应性最强的种属，因此虽然PIF 的加工环境(包括原辅料、预处理、喷雾干燥、流化床和包装等环节)已经得到了严格的监管 和控制，但是目前市售的PIF中克罗诺杆菌的污染率仍高达4.3%，可见该致病菌的污染已 经严重影响和制约了我国PIF行业的健康发展。
[0003] 目前对PIF中克罗诺杆菌的防控主要是对成品的检验和对生产原料、生产环境的 监管，这种分离的检验监管方法并不能从根本上针对性的对PIF中克罗诺杆菌进行防控。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明提供一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法。
[0005]克罗诺杆菌是一个新兴的多样性丰富的属，目前在克罗诺杆菌多位点序列分型数 据库（Multilocus Sequence Typing，MLST，http: //www.pubmlst ·org/cronobacter)中已 包含1090株不同来源的克罗诺杆菌，这些菌株被分为336个序列型（sequence types，STs)， 这显示了其高度的遗传多样性。同时，克罗诺杆菌高度的遗传多样性增加了其在不良环境 中存活的可能性，即一些在种群结构中占优势的克罗诺杆菌更能够适应不良的环境，因此 系统的研究PIF及其加工环境中克罗诺杆菌的遗传多样性，可以追溯PIF成品中的克罗诺杆 菌来源，更有针对性的进行该致病菌的防控，从而制定切实有效的防控措施。
[0006] 该方法利用多位点序列分型技术，对分离自相同品牌相同批次的PIF原辅料、半成 品、成品及其加工环境的克罗诺杆菌进行分子分型研究，在此基础上，以该致病菌的ST和环 境来源为变量进行相关性分析，确定PIF加工过程中最易污染克罗诺杆菌的关键环节和分 布规律，达到追溯该致病菌的目的，从而实现从根源上对PIF中克罗诺杆菌进行针对性防 控。
[0007] 步骤为：
[0008] 1)将从相同品牌相同批次的PIF、PIF原辅料、半成品、成品及其加工环境采集样品 中得到的克罗诺杆菌，提取DNA，对提取的DNA的16SrRNA序列进行扩增，对得到的16SrRNA的 PCR产物进行基因测序，并将得到的序列在GENBANK数据库中进行比对，完成分子鉴定；
[0009] 2)看家基因的特异性扩增:合成看家基因的引物，以克罗诺杆菌DNA为模板进行特 异性扩增；
[0010] 3)看家基因测序:将克罗诺杆菌看家基因的PCR产物测序，获得克罗诺杆菌看家基 因的核酸序列；
[0011] 4)克罗诺杆菌MLST序列型的确定:登录克罗诺杆菌MLST数据库，对每株克罗诺杆 菌的看家基因等位基因进行序列查询，获得每株菌的等位基因号，并根据等位基因号确定 克罗诺杆菌最终的序列型；
[0012] 5)克罗诺杆菌的溯源分析:利用SPSS软件，以分离自PIF加工环境的株克罗诺杆菌 的MLST序列型和加工过程关键控制点为变量进行相关性分析，得到克罗诺杆菌MLST序列型 与关键控制点之间的相关性，从而追溯克罗诺杆菌的污染源头，确定克罗诺杆菌的污染途 径。
[0013] 具体步骤为：
[0014] 1)将从相同品牌相同批次的PIF、PIF原辅料、半成品、成品及其加工环境采集样品 中得到的克罗诺杆菌，提取DNA，选取27-F和1492-R引物对提取的DNA的16SrRNA序列进行扩 增，PCR扩增体系为 10 X rTaq Buffer (含 15mmo 1 /L MgCl 2) 5 · OyL，dNTP(2 · 5mM) 4 · OyL，模板 DNA2 · OyL，27-F1 · OyL，1492-R1 · OyL，Taq DNA聚合酶0 · 5yL，ddH2036 · 5yL;扩增条件为95°C 预变性5min，95°C变性lmin，58°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次，最后72°C延伸5min;利 用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行验证，并在UVP紫外呈相系统下观察实验结果；对 16SrRNA的PCR产物进行基因测序，选择双向测通，并将得到的序列在GENBANK数据库中进行 比对，完成分子鉴定；其中27-F、1492-R引物序列见SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2;
[0015] 2)看家基因的特异性扩增:合成7对看家基因3七口0、;1^184、81113、8]^13、85^13、;[1^13和 PPsA的引物，引物序列见SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 16,以克罗诺杆菌DNA为模板进行特异性 扩增，7对引物的PCR扩增体系和条件相同，PCR扩增体系为lOXrTaq Buffer(含15mmol/L MgC12)5.0yL，dNTP(2.5mM)4.0yL，模板DNA5.0yL，上游引物l.OyL，下游引物 1.0yL，Taq DNA 聚合酶 1. OyL，ddH2033. OyL;扩增条件为 94°C 预变性 2min，94°C 变性 lmin，58°C 退火 lmin，72 °C延伸2min，循环30次，最后72°C延伸5min;PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验，并在 UVP紫外凝胶呈相系统下观察记录结果；
[0016] 3)看家基因测序:将克罗诺杆菌7对看家基因的PCR产物送样、纯化，单向测通，获 得克罗诺杆菌7个看家基因的核酸序列；
[0017] 4)克罗诺杆菌MLST序列型的确定：登录克罗诺杆菌MLST数据库，对每株克罗诺杆 菌的7个等位基因进行序列查询，获得每株菌的等位基因号，并根据7个等位基因号确定克 罗诺杆菌最终的序列型；
[0018] 5)克罗诺杆菌的溯源分析:利用SPSS软件，以分离自PIF加工环境的克罗诺杆菌的 MLST序列型和加工过程关键控制点为变量进行相关性分析，得到克罗诺杆菌MLST序列型与 关键控制点之间的相关性，从而追溯克罗诺杆菌的污染源头，确定克罗诺杆菌的污染途径。
[0019] 表1 16S rRNA PCR扩增体系和参数
[0021 ]表2 7对看家基因扩增体系和扩增条件和参数
[0022]
[0023]表3试验中的引物序列
[0024]
【附图说明】
[0025] 图1 7个看家基因的PCR结果；
[0026]图2 PIF及其加工环境中克罗诺杆菌STs的组成；
[0027]图3 7个看家基因最小似然系统发育树：图3 a:atpD基因最小似然系统发育树；图 3 b:fusA基因最小似然系统发育树；图3 c:glnS基因最小似然系统发育树；图3 d:gltB基 因最小似然系统发育树；图3 e:gyrB基因最小似然系统发育树；图3 f:infB基因最小似然 系统发育树;图3 g: infB基因最小似然系统发育树；
[0028] 图4 70株克罗诺杆菌最大似然系统发育树；
[0029] 图5 PIF加工环境与克罗诺杆菌序列型相关性分析。
【具体实施方式】
[0030] 主要试剂：
[0033]实施例1克罗诺杆菌的活化、纯化及鉴定
[0034]供试菌株为80株克罗诺杆菌，其中43株分离自PIF，27株分离自PIF的加工环境，4 株为克罗诺杆菌参考菌株（C.sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004， C.sakazakii ATCC 29544和C.sakazakii ATCC 12868)，6株为克罗诺杆菌模式株 (C.malonaticus CDC105877T,C.dublinensis LMG23823T,C.turicensis LMG23827T, C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGT和C.腿ytjensii ATCC 51329T)。此外 E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 35030、Escherichia CMCCB 44113和 Escherichia 0157作为外参菌株。具体情况如表4所不，且上述供试菌株均来自于东北农业 大学乳品科学教育部重点实验室503实验室。
[0035] 表4供试菌株及其来源
[0036] Table 2-1 The strains and their sources
[0040] (1)克罗诺杆菌的活化
[0041 ] 按照25g(LB): 1 OOOmL(蒸馏水）的比例配置LB液体培养基，并采用121°C下高温灭 菌30min后冷却，并按照10mL的量分装在无菌试管中待用。从深冷冰箱中取出80株甘油保存 的克罗诺杆菌，先在4 °C冰箱中解冻，再在室内恢复到室温。按照1 %的接种量将1 OOyL的克 罗诺杆菌菌液接种到lOmLLB培养基中，在37°C中培养12h达到活化的目的。
[0042] (2)克罗诺杆菌的纯化
[0043] 按照40g(TSA): 1 OOOmL(蒸馏水）的比例配置TSA培养基，采用121°C，30min的条件 下高温灭菌，并在无菌培养皿中倒平板，冷却后对克罗诺杆菌进行三区划线。在37°C培养箱 中培养24h，挑取克罗诺杆菌单菌落并接种到LB液体培养基中，37°C培养12h得到克罗诺杆 菌的纯培养液。
[0044] (3)克罗诺杆菌DNA的提取
[0045]吸取纯化后的克罗诺杆菌菌悬液2mL，按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒使用说 明对80株克罗诺杆菌进行DNA的提取，提取后的DNA存放在-20 °C待用。
[0046] (4)克罗诺杆菌的分子鉴定
[0047] 按照表3中的引物序列，选取27-F和1492-R引物对克罗诺杆菌DNA的16SrRNA序列 进行扩增，反应体系和扩增条件见表5。利用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行验证， 并在UVP紫外呈相系统下观察实验结果。最后将克罗诺杆菌16SrRNA的PCR产物送往北京诺 赛基因组研究中心有限公司进行基因测序，选择双向测通，并将得到的序列在GENBANK数据 库中进行比对，完成克罗诺杆菌的分子鉴定结果表明待测的70株菌株均属于克罗诺杆菌 属，相似程度均彡99 %。
[0048] 表5 16S rRNA PCR扩增体系和参数
[0050]实施例2克罗诺杆菌的多位点序列分型 [0051 ] (1 )7对看家基因特异PCR扩增及基因测序
[0052] (1)7对看家基因的特异性扩增
[0053] 合成7对看家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA)的引物(基因序列见 表3)，以克罗诺杆菌DNA为模板进行特异性扩增，7对引物的PCR扩增体系和条件相同，如表6 所示。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验，并在UVP紫外凝胶呈相系统下观察记录结 果，结果如图1所示。7个看家基因的目的条带清晰，根据条带位置判断其产物序列大小为7 个看家基因的目的条带。
[0054]表6 7对看家基因扩增体系和扩增条件和参数
[0056] (2)看家基因的基因测序
[0057] 将克罗诺杆菌7对看家基因的PCR产物送样、纯化，单向测通，获得克罗诺杆菌7个 看家基因的核酸序列。
[0058] (3)克罗诺杆菌的MLST分型
[0059] (1)克罗诺杆菌MLST序列型的确定
[0060] 登录克罗诺杆菌MLST数据库(http ://pubmlst · org/cronobacter/)，选择等位基 因序列查询，输入基因测序序列，对每株克罗诺杆菌的7个等位基因进彳丁序列查询，获得每 株菌的等位基因号、克隆复杂度(CC)和序列型（ST)，并将序列信息提交到MLST数据库中得 到每株克罗诺杆菌在克罗诺杆菌数据库中的标识码(ID)，结果如表7所示。
[0061 ] 表7 70株克罗诺杆菌MLST信息表
[0064] (1)等位基因
[0065] 通过数据库比对，得到7个看家基因的等位基因号如下：
[0066] atpD:atpDl、atpD3、atpD5、atpD10、atpDll、atpD16、atpD18、atpD19、atpD55、 atpD89;
[0067] fusA: fusAl、fusA7、fusA8、fusAl 1、fusA12、fusA13、fusA14、fusA15、fusA16、 fusA17、fusA37;
[0068] glnS:glnSl、glnS3、glnS6、glnS7、glnS9、glnS10、glnS13、glnS16、glnS19、 glnS28、glnS37、glnS59、glnS107、glnS108;
[0069] gltB:gltBl、gltB3、gltB5、gltB8、gltB12、gltB15、gltB18、gltB19、gltB22、 gltB40、gltB41、gltB99、gltB109、gltB127、gltB128;
[0070] gyrB:gyrBl、gyrB5、gyrB8、gyrB9、gyrB10、gyrBll、gyrB15、gyrB16、gyrB18、 gyrB19、gyrB22、gyrB26、gyrB29、gyrB70、gyrB74、gyrB125;
[0071] infB:infBl、infB3、infB5、infB14、infB15、infB17、infB20、infB24、infB35、 infB36、infB38、infB56、infB70;
[0072] ppsA:ppsAl、ppsM、ppsA9、ppsA10、ppsA13、ppsA14、ppsA18、ppsA19、ppsA21、 ppsA23、ppsA26、ppsA32、ppsA80、ppsA102、ppsA160、ppsA161。
[0073] 其中发现了8个新的等位基因，分别为：atpD89、glnS107、glnS108、gltB127、 gltB128、gyrB125，ppsA160和ppsA161。
[0074] (2)MLST序列型的确定
[0075] 70株克罗诺杆菌被分为了 19个序列型，分别为：ST1、ST4、ST8、ST12、ST17、ST21、 ST22、ST31、ST40、ST50、ST64、ST83、ST201、ST258、ST259、ST268、ST260、ST269 和 ST261，其中 5丁258、5了259、5了268、5了260、5了269和5了261是新的序列型，且5了201和5了258为丙二酸阳性克 罗诺杆菌的序列型。
[0076] (2)基于MLST的克罗诺杆菌的系统发育分析
[0077]拼接克罗诺杆菌的7个看家基因，得到长度为3036bp的基因序列。利用Mega6.0软 件，对70株克罗诺杆菌进行系统发育分析，选择最大似然算法（Minimum like 1 ihood algorithm)，程序重复1000次，构建克罗诺杆菌的系统发育树，并选择C. sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004，C.sakazakii ATCC 29544、C.sakazakii ATCC 12868、 C.malonaticus CDC105877T,C.dublinensis LMG23823T,C.turicensis LMG23827T, C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGWPC.muytjensii ATCC 51329T作为参考和 模式菌株。
[0078]通过饼状图展现PIF及其加工环境中克罗诺杆菌的种群特征，如图2所示。
[0079] 70株克罗诺杆菌中阪崎克罗诺杆菌66株，丙二酸阳性克罗诺杆菌4株，这说明在 PIF及其加工环境中阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属的优势种。在ST方面，ST4的菌株为18 株，占总数的27 % ; ST1的菌株为14株，占总数的21 % ; ST64的菌株为11株，占总数的16 % ;之 后为ST12(3株，5%)、ST21(3株，5%)和ST258(3株，5%)、ST22(2株，3%)、ST8(2株，3%)、 ST261(2株，3%)和ST260(2株，3%);其他9个ST都只有1株克罗诺杆菌，分别为:ST17、ST31、 ST40、ST51、ST83、ST201、ST259、ST268和ST260。可见PIF及其加工环境中克罗诺杆菌的优势 序列型为ST4、ST1和ST64,此外ST258(3/4,75%)是数量最多的丙二酸阳性克罗诺杆菌ST。
[0080] (4)克罗诺杆菌看家基因的系统发育分析
[0081] 以E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 35030、Escherichia CMCCB 44113 和Escherichia 0157作为外参菌株，利用Mega6.0软件对不同的等位基因进行系统发育分 析，得到7个看家基因的最大似然系统发育树，如图3所示。
[0082]图3(a_g)展现出了 7个看家基因清晰的系统发育关系，7个看家基因都没有出现明 显的水平基因转移，这说明7个看家基因比较保守。其中atpD、fusA、gyrB和infB的系统发育 树中的外参菌株远离其他序列，而glnS中E.cloacae ATCC 35030和克罗诺杆菌有相近的系 统发育关系，gltB中E.cloacae ATCC 35030和克罗诺杆菌有相近的系统发育关系，ppsA中 E. aerogenes ATCC13048和克罗诺杆菌有相近的系统发育关系。
[0083] (5)克罗诺杆菌不同MLST序列型的系统发育分析
[0084] 70株克罗诺杆菌（具有19个不同的MLST序列型）的最小似然系统发育树如图4所 示。C.sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004，C.sakazakii ATCC 29544和 C.sakazakii ATCC 12868为参考菌株，C.malonaticus CDC105877T，C.dublinensis LMG23823T，C.turicensis LMG23827T，C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGT和 C.muytjensii ATCC 5132#为克罗诺杆菌模式株。
[0085]图4显示了克罗诺杆菌清晰的系统发育关系，克罗诺杆菌属的7个种都相互保持了 一定的距离，而在这7个种中，阪崎克罗诺杆菌和丙二酸阳性克罗诺杆菌显示了更近的系统 关系。在阪崎克罗诺杆菌种内，ST4和ST258、ST64和ST261具有更近的系统发育关系;在丙二 酸阳性克罗诺杆菌种内ST201和ST7(C.malonaticus CDC 105877)的系统发育关系较近。而 根据MLST数据库比对的结果，这些相近ST之间只相差一个碱基，由于MLST分型能够反应整 个基因组的系统发育关系，因此ST4和ST268、ST64和ST261、ST201和ST7的菌株很可能在整 个基因组层面的系统发育关系也比较相近。
[0086] (6)克罗诺杆菌的溯源分析
[0087] 利用SPSS软件，以分离自PIF加工环境的27株克罗诺杆菌的MLST序列型和加工过 程关键控制点（原辅料、巴杀浓缩后、喷雾干燥后、流化床出口、车间终产品等)为变量进行 相关性分析，得到克罗诺杆菌MLST序列型与关键控制点之间的相关性，从而追溯克罗诺杆 菌的污染源头，确定克罗诺杆菌的污染途径，结果如图5所示。
[0088]参与分析的克罗诺杆菌共计27株，均分离自某PIF工厂关键生产环节的生产环境 及原辅料和终产品中，这些检测到克罗诺杆菌的关键控制点包括喷雾干燥、流化床、固定 床。通过相关性分析发现原辅料与克罗诺杆菌ST17和ST258相关、固定床与克罗诺杆菌 ST269相关、然而ST17、ST258和ST269型的克罗诺杆菌并没有出现在车间终产品中，因此虽 然在原辅料和固定床上分离到了克罗诺杆菌，但是这两个环节并不是克罗诺杆菌的污染途 径；同时，ST1与喷雾干燥、流化床和车间终产品都相关，ST64与流化床和车间终产品相关， 这说明喷雾干燥和流化床是克罗诺杆菌的污染途径;此外，ST4与车间终产品具有相关性， 虽然ST4型的克罗诺杆菌没有出现在加工环节中，但是却在车间终产品中出现，这说明ST4 型的克罗诺杆菌是通过PIF的包装环节污染产品的。
【主权项】
1. 一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源方法，其特征在于：利用多位点序列分型技 术，对市售PIF、PIF原料、半成品、成品及其加工环境的克罗诺杆菌进行分子分型研究，揭示 其种群特征，明确克罗诺杆菌的系统发育关系，并通过生物信息学对克罗诺杆菌进行系统 发育分析，从而系统的揭示上述环境中克罗诺杆菌的遗传特征;在克罗诺杆菌MLST分型的 基础上，以该致病菌的ST和环境来源为变量进行相关性分析，确定PIF加工过程中最易污染 克罗诺杆菌的关键环节和分布规律，从而追溯婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的来源。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤为： (1) 将从相同品牌相同批次的PIF、PIF原辅料、半成品、成品及其加工环境采集样品中 得到的克罗诺杆菌，提取DNA，对提取的DNA的16SrRNA序列进行扩增，对得到的16SrRNA的 PCR产物进行基因测序，并将得到的序列在GENBANK数据库中进行比对，完成分子鉴定； (2) 看家基因的特异性扩增:合成看家基因的引物，以克罗诺杆菌DNA为模板进行特异 性扩增； (3) 看家基因测序:将克罗诺杆菌看家基因的PCR产物测序，获得克罗诺杆菌看家基因 的核酸序列； (4) 克罗诺杆菌MLST序列型的确定:登录克罗诺杆菌MLST数据库，对每株克罗诺杆菌的 看家基因等位基因进行序列查询，获得每株菌的等位基因号，并根据等位基因号确定克罗 诺杆菌最终的序列型； (5) 克罗诺杆菌的溯源分析:利用SPSS软件，以分离自PIF加工环境的株克罗诺杆菌的 MLST序列型和加工过程关键控制点为变量进行相关性分析，得到克罗诺杆菌MLST序列型与 关键控制点之间的相关性，从而追溯克罗诺杆菌的污染源头，确定克罗诺杆菌的污染途径。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:具体步骤为： 1) 将从相同品牌相同批次的PIF、PIF原辅料、半成品、成品及其加工环境采集样品中得 到的克罗诺杆菌，提取DNA，选取27-F和1492-R引物对提取的DNA的16SrRNA序列进行扩增， PCR扩增体系为 IO X rTaq Buf f er (含15mmoI/L MgCl2) 5 · OyL，dNTP(2 · 5mM)4 · OyL，模板 DNA2 · OyL，27-F1 · OyL，1492-R1 · OyL，Taq DNA聚合酶0 · 5yL，ddH2036 · 5yL;扩增条件为95°C 预变性5min，95°C变性lmin，58°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次，最后72°C延伸5min;利 用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行验证，并在UVP紫外呈相系统下观察实验结果；对 16SrRNA的PCR产物进行基因测序，选择双向测通，并将得到的序列在GENBANK数据库中进行 比对，完成分子鉴定；其中27-F、1492-R引物序列见SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2; 2) 看家基因的特异性扩增:合成7对看家基因3七口0、作84、81]13、8]^13、87池、;[1^13和口口8八 的引物，引物序列见SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 16,以克罗诺杆菌DNA为模板进行特异性扩 增，7对引物的PCR扩增体系和条件相同，PCR扩增体系为10 XrTaq Buffer(含15mmol/L MgC12)5.0yL，dNTP(2.5mM)4.0yL，模板DNA5.0yL，上游引物l.OyL，下游引物 1.0yL，Taq DNA 聚合酶1.0 yL，ddH2033. OyL;扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性Imin，58°C退火Imin，72 °C延伸2min，循环30次，最后72°C延伸5min;PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验，并在 UVP紫外凝胶呈相系统下观察记录结果； 3) 看家基因测序:将克罗诺杆菌7对看家基因的PCR产物送样、纯化，单向测通，获得克 罗诺杆菌7个看家基因的核酸序列； 4) 克罗诺杆菌MLST序列型的确定:登录克罗诺杆菌MLST数据库，对每株克罗诺杆菌的7 个等位基因进行序列查询，获得每株菌的等位基因号，并根据7个等位基因号确定克罗诺杆 菌最终的序列型； 5)克罗诺杆菌的溯源分析:利用SPSS软件，以分离自PIF加工环境的克罗诺杆菌的MLST 序列型和加工过程关键控制点为变量进行相关性分析，得到克罗诺杆菌MLST序列型与关键 控制点之间的相关性，从而追溯克罗诺杆菌的污染源头，确定克罗诺杆菌的污染途径。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述加工过程关键控制点为原辅料、巴杀 浓缩后、喷雾干燥后、流化床出口、车间终产品。
【文档编号】C12Q1/68GK105950744SQ201610382169
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】姜毓君, 满朝新, 费鹏, 孙露宏, 潘瑞丽
【申请人】东北农业大学