一种基于rs417014745 SNP位点辅助鉴定绵羊生长性状的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于rs417014745 SNP位点辅助鉴定绵羊生长性状的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：检测待测绵羊的基因组DNA中rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG基因型还是GA基因型，AA基因型绵羊的生长性状优于GA基因型绵羊；GA基因型绵羊的生长性状优于GG基因型绵羊。本发明还保护一种特异引物对，由引物F和引物R组成，分别如序列表的序列1和序列表的序列2所示。应用本发明的方法可以辅助筛选生长性状优的绵羊，对于绵羊的育种具有重要意义，也对于进一步研究绵羊的生长性状具有重要意义。
【专利说明】
一种基于rs417014745 SNP位点辅助鉴定绵羊生长性状的 方法
技术领域
[00011本发明涉及一种基于rs417014745 SNP位点辅助鉴定绵羊生长性状的方法。
【背景技术】
[0002] SNP(single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性）主要指在基因组水平， 由单个核苷酸的变异引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。在基因组中分 布密集的SNP，因其携带巨大的遗传信息量，被认为是应用前景最好的遗传标记物，人类SNP 标记的检测已经成为基因诊断的重要手段。SNP标记的遗传图谱的研究，对分子辅助育种有 巨大的促进作用，农业动物中很多重要性状的基因已经定位。
[0003] 绵羊是世界及我国具有重要经济性状的家畜，为人类提供了大量的肉、毛、皮等产 品。利用传统的育种方法对绵羊的选育与提高取得了显著的效果，促进了地方绵羊群体的 改良和各地绵羊新品种的形成，然而，运用传统的育种方法对绵羊的遗传改良的进展十分 缓慢，一个新品种的形成就需要上十年甚至几十年的时间。随着分子生物学技术的出现与 发展，特别是人类基因组研究的开展和其他物种基因组的研究提上新的日程，带动了绵羊 基因组的研究。绵羊前期的分子生物学方面的研究主要集中在以标记为基础构建绵羊物种 的遗传连锁图谱，以连锁图谱为基础的重要经济性状的定位、以候选基因法为基础的基因 克隆及其结构与功能研究、分子标记育种应用等。近几十年来，绵羊基因组的研究成果有 限，因此，对绵羊基因组的研究是迫在眉睫的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于rs417014745 SNP位点辅助鉴定绵羊生长性状的方 法。
[0005] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定绵羊生长性状的方法，包括如下步骤：
[0006] 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG 基因型还是GA基因型；
[0007] 如果为AA基因型、待测绵羊候选为体重大和/或胸围大的绵羊，如果为GG基因型或 GA基因型、待测绵羊候选为体重小和/或胸围小的绵羊;所述体重大体现为四月龄时体重大 于等于28kg和/或六月龄时体重大于等于3lkg;所述胸围大体现为四月龄时胸围大于等于 77cm和/或六月龄时胸围大于等于79cm;所述体重小体现为四月龄时体重小于28kg和/或六 月龄时体重小于31kg;所述胸围小体现为四月龄时胸围小于77cm和/或六月龄时胸围小于 79cm 〇
[0008] 所述绵羊具体可为4月龄或6月龄的绵羊。
[0009] 所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0010] 本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别绵羊的生长性状的方法，包括如下步骤：
[0011] 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG 基因型还是GA基因型；
[0012] AA基因型绵羊的生长性状在统计学上显著优于GG基因型绵羊和GA基因型绵羊；
[0013] 生长性状优体现为体重大和/或胸围大。
[0014] 所述绵羊具体可为4月龄或6月龄的绵羊。
[0015] 所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0016] 本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别绵羊生长性状的方法，包括如下步骤：
[0017] 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG 基因型还是GA基因型；
[0018] AA基因型绵羊的生长性状优于GA基因型绵羊，GA基因型绵羊的生长性状优于GG基 因型绵羊。
[0019] 生长性状优体现为如下(al)至(a5)中的至少一种：（al)体重大；（a2)胸围大；（a3) 体高大；（a4)体斜长大；（a5)管围大。
[0020] 当生长性状优体现为体重大时，AA基因型绵羊的体重在统计学上大于GA基因型绵 羊，GA基因型绵羊的体重大于GG基因型绵羊。
[0021 ]当生长性状优体现为胸围大时，AA基因型绵羊的胸围在统计学上大于GA基因型绵 羊，GA基因型绵羊的胸围大于GG基因型绵羊。
[0022] 当生长性状优体现为体高大时，AA基因型绵羊的体高大于GA基因型绵羊，GA基因 型绵羊的体高大于GG基因型绵羊。
[0023] 当生长性状优体现为体斜长大时，AA基因型绵羊的体斜长大于GA基因型绵羊，GA 基因型绵羊的体斜长上大于GG基因型绵羊。
[0024] 当生长性状优体现为管围大时，AA基因型绵羊的管围大于GA基因型绵羊，GA基因 型绵羊的管围大于GG基因型绵羊。
[0025] 所述绵羊具体可为4月龄或6月龄的绵羊。
[0026] 所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0027]以上任一所述方法中，所述"检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP 位点的基因型"包括如下步骤：以待测绵羊的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩 增，然后将PCR扩增产物进行测序；
[0028] 所述特异引物对由引物F和引物R组成；
[0029] 所述引物F为如下(bl)或(b2):
[0030] (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0031] (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0032] 所述引物R为如下(b3)或(b4):
[0033] (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0034] (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有 相同功能的DNA分子。
[0035] 本发明还保护上述特异引物对。所述特异引物对的用途为辅助鉴定绵羊生长性 状。所述生长性状为如下(al)至(a5)中的至少一种：（al)体重；（a2)胸围；（a3)体高；（a4)体 斜长;（a5)管围。所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0036] 本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(cl)或(c2):
[0037] (cl)辅助鉴定绵羊的生长性状；
[0038] (c2)制备辅助鉴定绵羊的生长性状的试剂盒。
[0039]所述生长性状为如下（dl)至(d5)中的至少一种：（dl)体重；（d2)胸围；（d3)体高； (d4)体斜长;（d5)管围。所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0040]本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒。所述试剂盒的用途为辅助鉴定绵羊 生长性状。所述生长性状为如下(dl)至(d5)中的至少一种：（dl)体重；（d2)胸围；（d3)体高； (d4)体斜长;（d5)管围。所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0041 ]本发明还保护一种与绵羊生长性状相关的含有所述rsrs417014745 SNP位点的 DNA片段，如序列表中序列3所示。所述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0042]本发明还保护以上任一所述方法，或，所述的引物对，或，所述的试剂盒，在绵羊的 育种中的应用。所述育种的目的是培育生长性状优的绵羊。生长性状优体现为如下(al)至 (a5)中的至少一种：（al)体重大；（a2)胸围大；（a3)体高大；（a4)体斜长大；（a5)管围大。所 述绵羊具体可为乌珠穆沁绵羊。
[0043]以上任一所述rs417014745 SNP位点具体可为绵羊基因组中序列表的序列3自5' 末端第66位核苷酸。
[0044] 本发明发现了一个rs417014745 SNP位点，发现rs417014745 SNP位点与绵羊生长 性状具有相关性。该SNP可以作为绵羊生长性状的分子标记，应用本发明的方法可以辅助筛 选生长性状优的绵羊，对于绵羊的育种具有重要意义，也对于进一步研究绵羊的生长性状 具有重要意义。
【附图说明】
[0045]图1为DNA混池测序结果图
[0046] 图2为飞行质谱分析结果图
【具体实施方式】
[0047] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0048]乌珠穆沁绵羊：内蒙古东乌穆沁羊原种场和正蓝旗羊场，实施例中绵羊的所有生 长数据均来自上述两个羊场。
[0049] 体斜长:由肩胛骨前缘到臀端的直线距离。
[0050] 管围：左前肢管部上三分之一的周围长度。
[0051] 胸深：由鬌胛最高点到胸骨底面的距离。
[0052]实施例1、SNP位点及基因分型
[0053] 针对绵羊MEF2B基因的各个外显子、绵羊MEF2B基因上游lOOObp的调控区以及绵羊 MEF2B基因下游lOOObp的调控区设计若干引物对，分别对各个绵羊群体中的每个个体进行 PCR扩增并测序，发掘SNP位点并对于SNP位点与不同性状进行关联分析。
[0054] 通过上述大量试验，得到特异引物对如下：
[0055] F(序列表的序列1) :5'-TCCCTTACCCTTTGCTCCTG-3' ；
[0056] R(序列表的序列2) :5'-CAGCATTCACTCACGGATCC-3'。
[0057] 靶序列位于绵羊MEF2B基因下游的调控区，约为500bp。
[0058] 在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中，选取其中30个个体的血液DNA样本，以相同浓 度组成混池 DNA，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。对测序峰 图进行分析，结合绵羊肉用性状全基因组关联分析，找到一个与绵羊断奶后日增重显著相 关SNP位点（rs417014745)，如图1所示。
[0059] r s 417 014 7 4 5 S NP位点位于ΜE F 2 B基因的下游调控区。乌珠穆沁绵羊基因组中 rs417014745 SNP位点周边的核苷酸序列如序列表的序列3所示，rs417014745 SNP位点位 于第66位，为A或G。
[0060]采用飞行质谱方法分别检测343只乌珠穆沁绵羊基于rs417014745 SNP位点的基 因型分型，结果如图2所示，位于A区域的个体基因型为GG，位于B区域的个体基因型为GA，位 于C区域的个体基因型为AA。
[0061 ] MEF2B基因如序列表的序列4所示。
[0062]实施例2、关联分析
[0063] 一、SNP位点与四月龄绵羊生长性状关联分析
[0064] 实验材料为181只乌珠穆沁绵羊，在相同条件下饲养。
[0065] 1、分别记录每个个体四月龄的体重、胸围、体高、体斜长、管围。
[0066] 2、分别取每个个体的血液样本并提取基因组DNA，采用F和R组成的引物对进行PCP 扩增，然后将PCR扩增产物进行测序，得到每个个体基于rs417014745 SNP位点的基因型。 [0067] 3、利用统计学软件对SNP位点与四月龄的乌珠穆沁绵羊的生长性状(体重、胸围、 体高、体斜长、管围)进行关联分析，统计结果见表1和表2。
[0068]表1 4月龄乌珠穆沁绵羊的生长性状与SNP位点的相关性结果
[0069]
[0070] 注：同行标有不同字母者表示组间差异显著；同行标有相同小写字母者表示组间 差异不显著。
[0071 ]表2 4月龄乌珠穆沁绵羊的生长性状统计结果
[0077] 基于rs417014745 SNP位点，181只乌珠穆沁绵羊中，9只为AA基因型、132只为GG基 因型、40只为GA基因型。9只AA基因型的绵羊中，77.78%的体重都大于等于28kg，平均值为 31.61kg; 132只GG基因型的绵羊中，81.28%的体重都小于28kg，平均值为24.57kg;40只GA 基因型的绵羊中，80.00%的体重都小于28kg，平均值为24.97kg(39只AA基因型的绵羊中， 77.78%的胸围都大于等于77cm，平均值为79.33cm; 132只GG基因型的绵羊中，90.15%的胸 围都小于77cm，平均值为71.65cm;40只GA基因型的绵羊中，85.00%的胸围都小于77cm，平 均值为72.48cm 〇
[0078] 建立如下方法:检测待测四月龄乌珠穆沁绵羊基于rs417014745 SNP位点的基因 型，AA基因型绵羊的的四月龄体重和/或胸围显著高于GG基因型及GA基因型。
[0079] 建立如下方法:检测待测四月龄乌珠穆沁绵羊基于rs417014745 SNP位点的基因 型，如果为AA基因型、绵羊体重大于等于28kg和/或胸围大于等于77cm，如果为GG基因型或 GA基因型、绵羊的体重小于28kg和/或胸围小于77cm。
[0080]二、SNP位点与六月龄绵羊生长性状关联分析 [00811实验材料为106只乌珠穆沁绵羊，在相同条件下饲养。
[0082] 1、分别记录每个个体六月龄的体重、胸围、体高、体斜长、管围、胸宽、胸深。
[0083] 2、分别取每个个体的血液样本并提取基因组DNA，采用F和R组成的引物对进行PCR 扩增，然后将PCR扩增产物进行测序，得到每个个体基于rs417014745 SNP位点的基因型。 [0084] 3、利用统计学软件对SNP位点与乌珠穆沁绵羊六月龄的生长性状(体重、胸围、体 高、体斜长、管围、胸宽、胸深)进行关联分析，统计结果见表3和表4。
[0085]表3 6月龄乌珠穆沁绵羊的生长性状与SNP位点的相关性结果
[0086]
[0087]注：同行标有不同字母者表示组间差异显著；同行标有相同小写字母者表示组间 差异不显著。
[0088]表4 6月龄乌珠穆沁绵羊的生长性状统计结果 [0089]
[0093] 基于rs417014745 SNP位点，106只乌珠穆沁绵羊中，8只为AA基因型、75只为GG基 因型、23只为GA基因型。8只AA基因型的绵羊中，100%的体重都大于等于31kg，平均值为 36.261^ ;75只66基因型的绵羊中，89.33%的体重都小于311^，平均值为26.991^;23只6八基 因型的绵羊中，86.96%的体重都小于31kg，平均值为27.791^。8只AA基因型的绵羊中，75% 的胸围都大于等于79cm，平均值为85.25cm;75只GG基因型的绵羊中，81.33%的胸围都小于 79cm，平均值为74.65cm; 23只GA基因型的绵羊中，86.96%的胸围都小于79cm，平均值为 7 5·61 cm 〇
[0094] 建立如下方法:检测待测六月龄乌珠穆沁绵羊基于rs417014745 SNP位点的基因 型，AA基因型绵羊的的六月龄体重和/或胸围显著高于GG基因型及GA基因型。
[0095] 建立如下方法:检测待测六月龄乌珠穆沁绵羊基于rs417014745 SNP位点的基因 型，如果为AA基因型、绵羊体重大于等于31kg和/或胸围大于等于79cm，如果为GG基因型或 GA基因型、绵羊的体重小于31kg和/或胸围小于79cm。
【主权项】
1. 一种鉴定或辅助鉴定绵羊的体重和/或胸围的方法，包括如下步骤： 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG基因 型还是GA基因型； 如果为AA基因型、待测绵羊候选为体重大和/或胸围大的绵羊，如果为GG基因型或GA基 因型、待测绵羊候选为体重小和/或胸围小的绵羊;所述体重大体现为四月龄时体重大于等 于28kg和/或六月龄时体重大于等于31kg;所述胸围大体现为四月龄时胸围大于等于77cm 和/或六月龄时胸围大于等于79cm;所述体重小体现为四月龄时体重小于28kg和/或六月龄 时体重小于31kg;所述胸围小体现为四月龄时胸围小于77cm和/或六月龄时胸围小于79cm〇2. -种鉴别或辅助鉴别绵羊的生长性状的方法，包括如下步骤： 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG基因 型还是GA基因型； AA基因型绵羊的生长性状在统计学上显著优于GG基因型绵羊和GA基因型绵羊； 生长性状优体现为体重大和/或胸围大。3. -种鉴别或辅助鉴别绵羊生长性状的方法，包括如下步骤： 检测待测绵羊的基因组DNA中基于rs417014745 SNP位点的基因型为AA基因型、GG基因 型还是GA基因型； AA基因型绵羊的生长性状优于GA基因型绵羊，GA基因型绵羊的生长性状优于GG基因型 绵羊。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于:生长性状优体现为如下(al)至(a5)中的至少 一种： (al)体重大； (a2)胸围大； (a3)体高大； (a4)体斜长大； (a5)管围大。5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，所述"检测待测绵羊 的基因组DNA中基于rs417014745SNP位点的基因型"包括如下步骤：以待测绵羊的基因组 DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序； 所述特异引物对由引物F和引物R组成； 所述引物F为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子。6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述待测绵羊为乌珠穆沁绵羊。7. 特异引物对，由引物F和引物R组成； 所述引物F为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子。8. 权利要求7所述引物对的应用，为如下(c 1)或(c2): (cl)辅助鉴定绵羊的生长性状； (c2)制备辅助鉴定绵羊的生长性状的试剂盒。9. 一种与绵羊生长性状相关的含有权利要求1至3中任一所述rs417014745SNP位点的 DNA片段，如序列表中序列3所示。10. 权利要求1至6中任一所述方法，或，权利要求7所述的特异引物对，在绵羊育种中的 应用。
【文档编号】C12N15/11GK105950742SQ201610375046
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】张莉, 马晓萌, 杜立新, 轩俊丽, 魏彩虹, 赵福平, 朱才业, 吴明明, 袁泽湖, 刘瑞凿
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所