专利名称：G6PC2基因3’区域上的rs16856187多态位点的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学技术领域的检测方法，具体是一种f^^i"(葡萄 糖6磷酸酶催化亚单位2)基因3'区域上的rsl6856187多态位点的检测方法。
技术背景6^月2基因位于染色体2q24.3，该基因编码的蛋白又称胰岛特异性葡萄糖 -6-磷酸相关蛋白(IGRP)，属于G6PC家族。该蛋白催化葡萄糖-6-磷酸分解为葡 萄糖和磷酸的水解反应。近期研究表明，G6PC2在胰岛细胞中高表达，对葡萄糖 激酶催化的葡萄糖分解反应具有调节作用，且可能影响胰岛素分泌。C^^i"基因 上的多态位点，如rsl6856187的研究有望成为糖尿病遗传学研究的新热点。为 适应国际上糖尿病遗传学研究的趋势，目前迫切需要建立在大规模样本中检测 C^T2基因上多态位点的稳定的方法。由于rsl6856187位点在白种人中十分罕 见，没有检测报道，在中国人群中也鲜有研究，因此国内外尚未有对该位点进行 大批量检测的相关报道。经对现有技术的文献检索发现，Sequenom公司在2005年针对MassARRAY iPlex技术公开发行了一份应用指南《iPLEX Application Guide》，该指南提及， MassARRAY iPlex方法是一种新型的用于高通量SNP检测方法，该方法利用单碱 基延伸和基质辅助激光解吸飞行质谱测定SNP位点基因型，该指南描述了此技术 的操作方法，包括如下步骤基因组DNA模板的提取；设计特异性核酸引物扩增 目的基因；测定SNP位点基因型等步骤。但是该方法对于SNP位点引物的设计只 描述了设计原则，并且无论是DNA的提取方法，还是引物设计的实际操作都使得 该方法在应用到具体基因时存在一定局限性。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种C6尸6^基因3'区域上的 rsl6856187多态位点的检测方法。本发明建立了一种在大批量样本中进行C^尸C2 基因rsl6856187多态位点快速检测的方法。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及的一种"^Ti^基因3'区域 上的rsl6856187多态位点的检测方法，步骤包括
步骤一，从样品中提取基因组DNA，以此作为DNA模板；
步骤二，设计一对可特异性扩增出含SEQ ID NO. 1所示序列中第101位核 苷酸多态性的扩增产物的核酸引物，利用该对引物扩增目的基因；
步骤三，测定rsl6856187多态位点基因型，检测SEQ ID NO. 1所示序列第 101位是否存在C到A的单核苷酸多态性。
步骤二中，所述一对核酸引物长度为18bp-30bp。
步骤三中，所述测定为，用单碱基延伸和利用基质辅助激光解吸飞行质谱 进行测定。
本发明从样品中提取基因组DNA，以此作为DNA模板；根据6^月2基因 rsl6856187多态位点设计一对特异性核酸引物，扩增目的基因；测定rsl6856187 多态位点基因型，检测SEQ ID NO. 1所示序列第101位是否存在C到A的单核苷 酸多态性。
本发明具有如下的有益效果本发明建立了一种在大批量样本中进行6^尸Ci" 基因rsl6856187多态位点快速检测的方法，本发明可利用一台MassARRAY iPLEX 设备，8小时内完成768个样本的rsl6856187多态位点检测。
图1为6^P(2基因结构及rs16856187多态位点示意图2为基质辅助激光解吸飞行质谱检测rsl2742393多态位点的结果示意图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件， 例如Sambrook等人所著分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
图1为^^P(2基因结构及rsl6856187多态位点示意图，如图所示，6^尸0" 基因包含5个外显子，rsl6856187多态位点位于6^尸(2基因3'端非翻译区。6^月2基因3'区域上的rsl6856187多态位点的检测具体检测步骤包括 步骤一，从样品中提取基因组DNA，以此作为DNA模板 用常规酚氯仿法从样品中提取基因组DNA，具体过程如下
(1) 取肝素抗凝的新鲜的人全血5ml，加入破膜液至总体积为50ml，破膜 液组成如下0. 32mmol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HC1、 5mmol/L MgCl2、 l%Triton-X 100，其中1000ml破膜液的配方为109. 5g蔗糖、10ml lMTris-HCl、 lml 5MMgCl2、 10ml Triton-X 100;充分混匀，于4000g离心10分钟，弃去上清液，重复操作 一次；
(2) 在沉淀中加入含0. 075mol/L NaCl、 0. 024mol/L EDTA的溶液4. 5ml， 其中，1000ml该溶液的配方为4. 38gNaCl、 240ml 0. 1MEDTA，充分混匀，再加入 蛋白酶K lmg, 5%SDS 0.5ml,其中，5%SDS的配制为:5gSDS加水至100ml;轻 轻混匀，得到混合溶液，上述过程均在4'C条件下操作；将混合溶液于37'C消化 过夜；
(3) 向混合溶液中加入5ml平衡的重蒸苯酚和5ml体积比为24:1的氯仿-异戊醇，摇10分钟，于4000g离心10分钟，弃去下层有机相；再加入5ml体积 比为24:1的氯仿-异戊醇，摇10分钟，于4000g离心10分钟，弃去下层有机相；
(5)加入0. 5ml 3mol/L醋酸钠溶液及12. 5ml的-20。C的无水乙醇，用实心 玻璃棒捞起状沉淀，取无水乙醇70ml加水稀释至lOOml，用该乙醇溶液洗涤沉 淀一次，待酒精挥发后，将沉淀溶解于500ul TE缓冲液中，于4'C溶解过夜； 将DNA样本原液混匀离心，用4倍原液体积的H20稀释后，用BioPhotometer生 物分光光度计测定稀释液浓度及OD260/OD280值，计算后将DNA样本稀释至 20ng/yl，储存于微量离心管，使用印Motion移液工作站将稀释好的样本加入 384孔储液板于4'C储存。
步骤二，设计一对可特异性扩增出含SEQ ID NO. 1所示序列中第101位核苷 酸多态性的扩增产物的核酸引物，利用该对引物扩增目的基因
PCR扩增目的基因，PCR及单碱基延伸在Mastercycler384孔热循环仪 (Eppendorf)上进行。
一对特异性核酸引物
PCR正向引物:5， -ACG TTG GAT GCA CAC CGT GAA TGA ACC TTC-3，， PCR反向引物5' -ACG TTG GAT GTG TTG GTG GCC TCA GTT TAC-3'，单碱基延伸引物5， -AAC CCC ATA CTA AAC TCC-3'。 PCR扩增目标序列，反应体系及步骤如下
反应体系
PCR缓冲液为:0.625ul; 10mM dNTP为:0.25yl;混合引物为lul; HotStarTaq酶为:0. lyl; DNA模板为:l.Oul; ddH20为:2.025ul;反应体
系总体积为5Ul。 反应步骤
94'C预变性为2 min:
进入循环94。C变性为20s， 56"C退火为10s， 65匸延伸为30s，共45
个循环；
最后65匸延伸为3 min。
SAP反应
反应体系
SAP反应缓冲液为O. 17U l;SAP酶为O. 30 U 1;PCR反应混合液为5. 00 U 1; ddH20为1.53Ul;反应体系总体积为7^1。 反应步骤
37。C温育40 min， 85。C加热5 min。 通过上述反应对目的基因进行扩增。
步骤三，测定rsl6856187多态位点基因型，检测SEQ ID NO. 1所示序列第 101位是否存在C到A的单核苷酸多态性 单碱基延伸反应 反应体系
iPLEX缓冲液为:0.200"; iPLEX反应终止液为:0.200yl; iPLEX酶为: 0.041yl;延伸引物液为0.804ul; SAP反应后混合液为:7.000ul; d顯
为0. 755lU;反应体系总体积为9. OOOnl。 反应步骤
94。C预变性为30S;
进入大循环94。C变性为5S，共40个大循环；
进入小循环52。C退火为5s， 8(TC延伸为5s，共5个小循环； 72。C延伸为3 min。基于质谱的SNP基因型检测在MassARRAY Compact Analyzer (Sequenom) 上进行，rsl6856187多态位点基因型检测和读取，在每个反应液中加入6 mg纯 化树脂，每个样本加入16u 1水，沿384孔板长轴旋转15min进行纯化反应，384 孔反应板4000 rpm离心5 min后，使用Nanodispenser点样转移至Spectro基 因芯片，在MassARRAY Analyzer Co卿act进行SNP基因型检测读取。基质辅助激 光解吸飞行质谱检测rsl2742393多态位点的结果示意图如图2所示，图2中， 分布在位置l内的样本为A/A基因型，分布在位置2内的样本为A/C基因型，分 布在位置3内的样本为C/C基因型。
结果标明，本发明的方法可利用一台MassARRAY iPLEX设备，8小时内完 成768个样本的rsl6856187多态位点检测，W尸C 基因rsl6856187多态位点在 3676例样本中的检测成功率达到96. 1%。序列表
〈110>上海交通大学
<120> 6Kft^基因3'区域上的rsl6856187多态位点的检测方法 〈160〉 1 <210> 1 <211〉 200 〈212〉醒
<213>人(Homo sapiens) <220>
<221〉 misc_feature <222> (101) <223> n=a或c 〈400〉 1
agtcatcaga actacattct agcctggccc tgcatxtaac cactaaaact ccagaaggcc 60 atttagtgtt ggtggcctca gtttacccag ttctcaactg nggagtttag tatggggtta 120 aaatggaeigg ttcattcacg gtgtgatatt cttcaactct gagggtctca ttcagtccaa 180 catattgtgc tttgtctctc 200
权利要求
1、一种G6PC2基因3’区域上的rs16856187多态位点的检测方法，其特征在于，步骤具体为步骤一，从样品中提取基因组DNA，以此作为DNA模板；步骤二，设计一对可特异性扩增出含SEQ ID NO.1所示序列中第101位核苷酸多态性的扩增产物的核酸引物，利用该对引物扩增目的基因；步骤三，测定rs16856187多态位点基因型，检测SEQ ID NO.1所示序列第101位是否存在C到A的单核苷酸多态性。
2、 根据权利要求1所述的C^^2基因3'区域上的rsl6856187多态位点的 检测方法，其特征是，步骤二中，所述一对特异性核酸引物长度为18bp-30bp。
3、 根据权利要求1所述的6W^2基因3'区域上的rsl6856187多态位点的 检测方法，其特征是，步骤三中，所述测定具体为，用单碱基延伸和利用基质辅 助激光解吸飞行质谱进行测定。
全文摘要
一种分子生物学技术领域的G6PC2基因3’区域上的rs16856187多态位点的检测方法，具体步骤为从样品中提取基因组DNA，以此作为DNA模板；设计一对可特异性扩增出含SEQ ID NO.1所示序列中第101位核苷酸多态性的扩增产物的核酸引物，利用该对引物扩增目的基因；测定rs16856187多态位点基因型，检测SEQ ID NO.1所示序列第101位是否存在C到A的单核苷酸多态性。本发明建立了一种在大批量样本中进行G6PC2基因rs16856187多态位点快速检测的方法。
文档编号C12Q1/68GK101514371SQ200910046349
公开日2009年8月26日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者蓉 张, 王从容, 承 胡, 贾伟平, 陆静毅 申请人:上海交通大学