专利名称：杂交瘤细胞株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的杂交瘤细胞株及其制备方法，具体是一 种分泌hAG2 (人类前梯度蛋白2，縮写为hAG2或AGR2)单克隆抗体的杂交瘤细 胞株及其制备方法。
背景技术：
在癌症的诊断和治疗中，单克隆抗体(mAb)及其相关技术日渐显示其不可 替代的作用。癌症诊断和治疗的研究需要很多特异性好、高质量的单克隆抗体。 hAG2 (human anterior gradient 2，人类前梯度蛋白2)是原发性和继发性肿 瘤的标识蛋白，并且是循环系统检出肿瘤细胞的标识蛋白，hAG2基因定位于 7p21.3。 hAG2在乳腺癌细胞系中与雌激素受体共表达，与雌激素敏感性乳腺癌 的分化表型及预后负相关，可作为激素敏感的乳腺癌的诊断和治疗的靶标。hAG2 在前列腺癌中为雄激素诱导分泌蛋白，并在前列腺癌中高表达，可作为前列腺 癌诊断和治疗的靶标。hAG2的表达量与患者的生存率成反比，可作为前列腺癌 患者的预后指标。
经对现有技术的文献检索发现，Florian Rudolf Fritzsche等在《Clinical Cancer Research》(临床癌症研究)2006年第6期12巻第1728-1734页发表了 《Prognostic Relevance of AGR2 Expression in Breast Cancer》(乳腺癌中 hAG2的表达与患者预后的相关性) 一文，文中指出，用一种兔抗人hAG2多肽的 多克隆抗体(稀释1000倍)，以Western blot分析来检测人前列腺癌细胞系PC-3 中hAG2蛋白的表达，在分子量20kD处检测到了 hAG2蛋白的特异性条带，但在 分子量20kD以上还有一条明显的非特异条带，而本发明所制备的单克隆抗体能 够针对性的解决这种不足，提高实验的精确度，可信度，同时这也是单克隆抗 体与多克隆抗体相比，其优势所在一特异性高。
发明内容
本发明的目的在于提供分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方 法。本发明的杂交瘤细胞株可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体，本发明的hAG2单克隆抗体滴度达lX10—6，能与天然及变性的hAG2蛋白结合，且抗原 表位位于hAG2蛋白的表面。
本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明所涉及的杂交瘤细胞株，名称为杂交瘤细胞株18A4，已提交中国典 型培养物保藏中心 (China Center for Type Culture Collection ，简称 CCTCC)，其保藏编号为CCTCC—C200902,保藏期限为2009年1月19日日起的 30年。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株的制备方法，具体步骤如下 步骤一，在pMal-c2载体中原核表达hAG2蛋白；
步骤二，利用步骤一得到的hAG2免疫4-12周龄BALB/c雌性小鼠，得到免 疫后的小鼠；
步骤三，将HAT培养液注入正常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部后回抽腹腔内液 体，离心，在沉淀下来的滋养细胞中加HAT培养液，注入96孔培养板进行培养；
步骤四，将步骤二得到的免疫后的小鼠处死，消毒，取小鼠脾脏制成脾细胞 悬液，经静置、离心、稀释、计数、RPMI-1640基础培养液洗涤，得到小鼠脾细 胞；
步骤五，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心，弃去上清液，加入 RPMI-1640基础培养液，离心，留下沉淀；
步骤六，在沉淀中加入HAT培养液，混匀后注入步骤三中的96孔培养板进 行培养；
步骤七，检测96孔培养板中的融合细胞，冲洗下阳性杂交瘤细胞，培养， 选取阳性杂交瘤细胞，反复培养杂交瘤细胞100%的分泌hAG2单克隆抗体为止， 得到稳定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
步骤二中，所述免疫具体为，加弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2 注射进小鼠背部和腹腔，注射hAG2的剂量为0. lmg，进行首次免疫，首次免疫 3周后进行加强免疫，每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量同首 次免疫，加强免疫用弗氏不完全佐剂，直至抗体滴度^1 : 10000，然后静脉注 射未乳化的hAG2进行冲击免疫，冲击免疫3天后小鼠可用于步骤四。
步骤五中，所述混合具体为，脾细胞与骨髓瘤细胞按(3 5): 1的个数比例进行混合。
步骤五中，所述加入RPMI-1640基础培养液具体为，在弃去上清液之后，弹 动离心管使细胞沉淀形成糊状，在37'C水浴条件下进行如下操作，水浴2min， 然后在lmin内加入lmLPEG4000,边加边摇动离心管，之后摇动45s，然后分4 次在7min内加入RPMI-1640基础培养液26mL，第一次lmin内加入lmL RPMI-1640 基础培养液，第二次2min内加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内 加入lOmL RPMI-1640基础培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培 养液，边加培养液边摇动离心管；其中，RPMI-1640基础培养液为RPMI-1640 培养液中加100U/ml青霉素-链霉素。
步骤六中，所述培养具体为，37°C、 C02体积浓度为5%、饱和湿度，培养3-5 天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次， 培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；其中，RPMI-1640完全培养 液为RPMI-1640基础培养液中加体积分数为10%的胎牛血清；HT培养液为 RPMI-1640完全培养液中加1X 10—4M的次黄嘌呤以及1. 6X 10—5M的胸腺嘧啶；HAT 培养液为HT培养液中加4X10—'M氨基喋呤。
步骤三和步骤七中，所述培养具体为，37'C、 (:02的体积浓度为5%、饱和湿度。
本发明涉及的由杂交瘤细胞株CCTCC一C200902分泌的hAG2单克隆抗体，其 制备方法包括如下步骤
步骤一，将液体石蜡注入6-12周龄BALB/c雄性小鼠腹腔，7天后将分泌 hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC一C200902注入小鼠腹腔；
步骤二，处死接种杂交瘤细胞的小鼠，消毒，收集腹水，4'C、 180g的条件 下离心5min，弃去上层油脂和下层沉淀，吸取中层淡黄色腹水，然后在4'C、 10 OOOg的条件下离心10min，弃去沉淀，保留腹水；
步骤三，将步骤二得到的腹水纯化，之后透析，最后得到hAG2单克隆抗体。
本发明具有如下的有益效果本发明分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株 CCTCC一C200902可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体；杂交瘤细胞株CCTCC 一C200902经体外连续传代培养，液氮冻存半年以上，复苏后仍生长良好，分泌 单克隆抗体的性能稳定；本发明制备出的hAG2单克隆抗体的滴度达lX10—6，两 次鉴定后其特异性高，能应用于免疫荧光及免疫沉淀，该单克隆抗体能与天然
6的及变性的hAG2蛋白结合，且抗原表位位于hAG2蛋白的表面。
图1为抗hAG-2单克隆抗体特异性的Western blot分析图2为抗hAG-2单克隆抗体对转染后细胞的Western blot分析图3为抗hAG-2单克隆抗体在MCF7细胞中免疫荧光检测hAG-2的图4为抗hAG-2单克隆抗体免疫沉淀后Western blot分析图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方
案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的
保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通
常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建
议的条件。
本部分涉及的相关溶液具体为，
RPMI-1640基础培养液具体为RPMI-1640培养液(购于GIBCO公司)中加 100U/ml青霉素-链霉素；
RPMI-1640完全培养液具体为RPMI-1640基础培养液中加体积分数为10% 的胎牛血清；
HT培养液具体为1640完全培养液中加1X10—、的次黄嘌呤(縮写为H), 1.6X10—5M的胸腺嘧啶(縮写为T);
HAT培养液具体为HT培养液中加4X10—7M氨基喋呤(縮写为A);
PBS具体为0.01M磷酸盐缓冲液8g NaCl、 0. 2g KCl、 1.44g化2訓4和 0.24g KH2P04，溶于1L蒸馏水中，pH值为7.4， 0. 01M指的是缓冲溶液中所有 的磷酸根浓度，Na离子和K离子是用来调节渗透压的；
弗氏完全佐剂具体为体积分数85%液状石蜡，体积分数15%单油酸甘露聚 糖甘，lmg/ml灭活的结核分支杆菌；
弗氏不完全佐剂具体为体积分数85%液状石蜡，体积分数15%单油酸甘露 聚糖甘。实施例1
本实施例提供了一种杂交瘤细胞株CCTCC一C200902，具体制备步骤包括 步骤一，在pMal-c2载体中原核表达hAG2蛋白；
步骤二，用Bradford法测定蛋白浓度，测定步骤参见Bradford蛋白浓度 测定试剂盒使用操作说明书。取0. lmg的hAG2，加入0. 25mL生理盐水，再加入 与hAG2和生理盐水混合液体积相等的弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2 分两点注射进6周龄BALB/c雌性小鼠背部，每一点注射20pg，其余的注射进小 鼠腹腔；首次免疫注射后第3周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强 免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，选用弗氏不 完全佐剂代替弗氏完全佐剂；直至抗体滴度^1 : 10000，然后静脉注射与首次 ,免疫注射剂量相同但不添加佐剂、未经乳化的hAG2， 3天后小鼠可用于后续步 骤实验；
步骤三，将正常8周龄BALB/c雌性小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于体积分数为 75W的酒精中5min，然后立即在超净工作台中剪开小鼠腹部皮肤，注意切勿剪破 小鼠腹膜，避免污染及腹腔液外流，用酒精棉球擦拭腹膜，将5mL-10mL HAT培 养液注入小鼠腹腔，注射器停留不动，揉捏小鼠腹部lmin 3min后回抽腹腔内 液体5mL注入离心管，在180g的条件下离心10min，弃去上清液，细胞沉淀加 20mL-50mL HAT培养液，重悬细胞，计数50个/pL-100个/^iL后注入96孔培养 板，每孔滴加80nL-120pL，在37""C、 C02体积浓度为5%、饱和湿度环境中培养、 观察，生长良好的滋养细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强；
步骤四，将步骤二得到的小鼠拉颈脱臼处死，用体积分数为75%的酒精消毒 后取出小鼠脾脏，去除结缔组织，放入RPMI-1640完全培养液中制成脾细胞悬 液，将脾细胞悬液注入离心管静置10min,弃去组织块沉淀，将不含有沉淀组织 块的上悬液移至另一离心管，在180g条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中 加入20mL RPMI-1640基础培养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽取lOpL悬浮液用磷 酸盐缓冲液稀释100-200倍，计数，再用40mL RPMI-1640基础培养液洗涤小鼠 脾细胞2-3次，得到小鼠脾细胞；
步骤五，骨髓瘤细胞的活细胞数> 95%，细胞生长密度过大的弃去不用，用 RPMI-1640基础培养液将生长良好的从培养容器壁上冲洗下来，收集冲洗下来的 骨髓瘤细胞并加入20mL RPMI-1640基础培养液，在180g条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL RPMI-1640基础培养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽 取10pL悬浮液用PBS稀释10-20倍，计数，再用40mL RPMI-1640基础培养液 洗涤骨髓瘤细胞2-3次，得到骨髓瘤细胞；其中骨髓瘤细胞具体为由绵羊红细 胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞与P3X63Ag8骨髓瘤细胞融合而成的SP2/0;不分泌 免疫球蛋白；对20ug/ml 8-氮鸟嘌呤有抗性，对HAT敏感；用于杂交瘤技术与 B细胞融合，购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；
步骤六，将步骤四的小鼠脾细胞与步骤五的骨髓瘤细胞按(3 5): 1的细 胞个数比例进行混合，将脾细胞与骨髓瘤细胞混合液在180g条件下离心5rain, 弃去上清液，轻轻弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，在37'C水浴条件下进行如 下操作，水浴2min，然后在lmin内加入lmL PEG4000 (聚乙二醇4000)，边加 边摇动离心管，之后轻轻摇动45s，然后分4次在7min内加入RPMI-1640基础 培养液26mL，第一次lmin内加入lmL RPMI-1640基础培养液，第二次2min内 加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640基础培 养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，边加培养液边不停的 摇动离心管，培养液加入完成立即在180g条件下离心5min，弃去上清液，留下 沉淀；
步骤七，向上一步细胞沉淀中缓慢加入100mLHAT培养液，重悬混匀后注入 步骤三中有滋养细胞的96孔培养板，在37'C， 0)2体积浓度为5%，饱和湿度的 环境中培养，培养3-5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT 培养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；
步骤八，克隆化阳性杂交瘤细胞:第一次克隆用HT培养液，否则用RPMI-1640 完全培养液，96孔培养板中融合细胞数量等于、大于10s个/mL，采用间接ELISA 方法检测杂交瘤细胞，RPMI-1640完全培养液将阳性杂交瘤细胞冲洗下来，并用 RPMI-1640完全培养液将细胞稀释至2500-3200个/mL，取0.1 ml即约300个细 胞加入10mlHT培养液，细胞浓度约为30个/ml;滴96孔板1. 2. 3列0.2 ml/ 孔即每孔约6个细胞，4.5.6列，0. lml/孔即每孔约3个细胞，加HT培养液， 将剩余细胞稀释3倍，细胞浓度约为10个/ml; 7. 8. 9列加0. 2 ml/孔即每孔约 2个细胞。10. 11. 12列0. 1 ml/孔即每孔约1个细胞。然后将96孔培养板置于 37'C、C02体积浓度为5%、饱和湿度的环境中克隆化培养，培养1周后用RPMI-1640 完全培养液半量换液培养，继续培养10-14天取培养上清液用间接ELISA方法检测并选取阳性杂交瘤细胞再次克隆化，置于37'C、 C02体积浓度为5%、饱和湿 度的环境中反复克隆化培养至100W的杂交瘤细胞分泌hAG2抗体为止，即获得稳 定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 实施例2
本实施例提供了一种杂交瘤细胞株CCTCC—C200902分泌的hAG2单克隆抗 体，该抗体制备方法包括
步骤一，将0. 5mL液体石蜡注入10周龄BALB/c雄性小鼠腹腔一周后，将 在180g条件下离心5min后重悬浮于生理盐水中的杂交瘤细胞株CCTCC一 C200902注入小鼠腹腔；
步骤二，拉颈脱臼处死接种杂交瘤细胞7-12天腹部明显膨大的小鼠，消毒 后收集腹水，腹水在4'C、 180《的条件下离心5mim弃去上层油脂和下层沉淀， 吸取中层淡黄色腹水，在4'C、 10 OOOg的条件下离心10迈in，弃去沉淀保留淡 黄色腹水，-8(TC的保存；
步骤三，采用G蛋白亲和层析技术纯化淡黄色腹水中的hAG2单克隆抗体， G蛋白亲和层析纯化步骤参见Amersham Biosciences公司HiTrap Protein G HP(HiTrap affinity columns)试剂盒使用操作说明书；之后，将装有hAG2单 克隆抗体的透析袋放入盛有1L PBS的容器中，透析24h，透析过程中透析液PBS 更换2次，即得到hAG2的单克隆抗体。
单克隆抗体的特异性鉴定是通过间接ELISA法、Ig亚类鉴定试剂盒及 Western blot分析进行的；通过质粒构建及转染后的Western blot分析对其特 异性进一步鉴定；用免疫荧光和免疫沉淀对其应用进行了确认，
(1)细胞蛋白提取的方法，具体步骤如下 步骤一，MCF7(乳腺癌细胞系)、MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)、293T (转染
腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制
起始点与启动子区的质粒可以复制)细胞长至培养皿底面积的90%，倒掉
RPMI-1640完全培养液后置于冰上，PBS冲液洗涤2次，然后加lOmLPBS，将细
胞刮下，180g于4'C离心5min，弃上清，留细胞沉淀；
步骤二，向步骤一得到的细胞中加细胞沉淀5倍体积的加蛋白酶抑制剂的
NP40裂解液，混匀，4'C裂解20min，然后20 OOOg于4'C离心lmin，收取上清，
Bradford法蛋白定量;NP40裂解液具体为:50mM Tris. Cl pH 6. 8、 15mMNaCl、5mM EDTA、 0. 5% NP-40;
(2) 单克隆抗体的特异性鉴定的方法，具体步骤如下-
步骤一，滴度测定采用间接ELISA法，以lmg/LhAG-2-MBP融合蛋白包被酶 标板，依次加入不同浓度的纯化后单克隆抗体及l : 10 000的HRP-山羊抗小鼠 IgG，加TMB (3， 3' ， 5， 5，-四甲基联苯胺)显色后，用酶标仪测定A。值； 其中，不同浓度的纯化后单克隆抗体具体为1: 101， 1: 102， 1: 103， 1: 104, 1: 105， 1: 106; 1: 10 ;
步骤二， Ig类和亚类的鉴定按Ig亚类鉴定试剂盒的说明书(购自HyCult
biotechnology bv公司)进行；
步骤三，特异性鉴定采用Western blot分析；取hAG-2-MBP融合蛋白， MBP (麦芽糖结合蛋白)及细胞蛋白提取的方法中提取的MCF7蛋白，经15% SDS-PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜上；滴加脱脂奶粉24'C封闭lh后，依 次加单克隆抗体4 。C孵育过夜，TBST洗膜3次及1 : 10 000服P-山羊抗小鼠 IgG 24'C孵育lh， TBST洗膜3次；将硝酸纤维素膜用ECL Plus处理5min后， 于暗室曝光到X-胶片上，显影、定影。
结果标明单克隆抗体的滴度达1X1(T;亚类测定结果表明hAG2的单克
隆抗体为IgG型，其中重链为IgGl，轻链为ic。图l为抗hAG-2单克隆抗体特 异性的Western blot分析图，图中1. AGR2-MBP融合蛋白；2.MBP; 3. MCF7细 胞提取蛋白。由图1可知，单克隆抗体与AGR2-MBP融合蛋白在分子量约为60 000 处出现1条清晰的带，与融合蛋白预期的分子量一致(MBP的分子量为40 kD， hAG-2的分子量为20 kD), 而与MBP未结合，与MCF7在分子量约为20 000处 出现1条清晰的带，说明此单克隆抗体的特异性，该单克隆抗体能与变性的hAG2 蛋白结合。
(3) 质粒构建及转染后对单克隆抗体的特异性进一步鉴定，具体步骤如下 步骤一，根据NCBI中提供的AGR2碱基序列，结合primer 5. 0软件(加拿大
Premier公司)设计引物，其上游引物设计Xba I酶切位点，下游引物设计Xho I 酶切位点，片段全长528个碱基(57 585氨基酸)，以MCF7乳腺癌细胞系cDNA 为模板进行PCR反应；
步骤二，回收扩增的目的片段，然后与经Xbal和XhoI双酶切后的pcDNA3 载体进行连接；步骤三，转染MDA-MB-231, 293T细胞，未连接的pcDNA3载体做阴性对照； 转染歩骤如下将生长状态良好的MDA-MB-231， 293T细胞铺至6孔板，贴壁后 PBS洗涤2次，加入500fiL转染液培养2h， PBS洗涤3次，换RPMI-1640完全 培养液，培养过夜；第二天，换新的RPMI-1640完全培养液，其中转染液具体 为在0.05mL RPMI-1640基础培养液中加0.02mg的DNA、 15吗的PEI (聚乙 烯亚胺)，混匀，24'C孵育8min后加入0.45mL含体积分数为10%的胎牛血清 的RPMI-1640基础培养液；
步骤四，24h—48h后，提取蛋白，进一步验证单克隆抗体的特异性；
步骤五，同单克隆抗体的特异性鉴定方法如步骤三。
图2为抗hAG-2单克隆抗体对转染后细胞的Western blot分析图，图2中，
1.MCF7细胞提取蛋白；2.转然后MDA-MB-231细胞提取蛋白；3.未转染
MDA-MB-231细胞提取蛋白；4.转然后293T细胞提取蛋白；5.未转染293T细胞
提取蛋白。由图2可知，单克隆抗体与MCF7，转染后的MDA-MB-231、 293T，在
分子量约为20 OOO处出现l条清晰的带，进一步说明此单克隆抗体的特异性。 (4)单克隆抗体免疫荧光应用的方法，具体步骤如下
步骤一，将MCF7、 MDA-MB-231、 293、 293T细胞从细胞培养皿转入6孔培 养板；
步骤二， 24h后，倒掉RPMI-1640完全培养液，PBS洗涤1次，质量分数 为4%的多聚甲醛，24。C，固定10min -20min， PBS洗涤1次；
步骤三，0.5%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚，中文名为曲拉通X-100) 24'C孵育2min -10min， PBS洗涤3次，每次5分钟；
步骤四，加抗hAG-2单克隆抗体，4'C孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5分
钟；
步骤五，加荧光标记的山羊抗小鼠二抗，24'C孵育30min， PBS洗涤3次， 每次5分钟；
步骤六，DAPI染色2min-5min， PBS洗涤2次，每次5分钟； 步骤七，荧光显微镜观察。
图3为抗hAG-2单克隆抗体在MCF7细胞中免疫荧光检测hAG-2的图，图中， (a)为加制备的单克隆抗体的免疫荧光检测示意图；(b)为未加单克隆抗体的免 疫荧光检测示意图。由图3可知，在400倍荧光显微镜镜下可见抗hAG-2单克隆抗体与MCF7细胞的hAG-2蛋白结合。
(5)单克隆抗体免疫沉淀应用的方法，具体步骤如下
步骤一，制备与抗体结合的Protein G Beads (G蛋白珠，购自Santa Cruz
公司)同时制备MBP-Beads (麦芽糖结合蛋白-G蛋白珠)对照及无单克隆抗 体对照将0.05ml protein G Beads,加入盛有10ml PBS的离心管中，混匀， 24。C孵育30min后，200g离心2min，去上清10 ml,约剩0. 05ml。取含抗hAG2 单克隆抗体或抗MBP单克隆抗体的RPMI-1640基础培养液10 ml分别加入0. 02 ml上述制备的Protein G Beads,混匀，24。C孵育2h; 200g离心去上清，用10ml raS洗涤2次，将与抗体结合的Protein G beads分别转入1. 5ml离心管，加 PBS至0.08ml, 4'C保存备用；
步骤二，免疫沉淀细胞蛋白提取的方法中提取的MCF7蛋白ling加抗体 -protein G beads悬浮液0.05ml，并用MBP-beads， protein G beads作对照，混 匀后4'C孵育过夜，200g离心去上清，用PBS 1ml洗涤4次，5xPAGE protein loading buffer悬浮沉淀，95'C加热5min;
步骤三，免疫沉淀后Western blot分析用以5XPAGE protein loading buffer悬浮hAG2-MBP融合蛋白即抗原、单克隆抗体进行免疫沉淀形成的抗原-抗体复合物、纯化后的抗hAG-2单克隆抗体后于95'C加热5miri，置于冰上冷却 10min，将上述3种样品经12g/L SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜上， 以后的步骤同单克隆抗体的特异性鉴定的方法中的步骤三。
图4为抗hAG-2单克隆抗体免疫沉淀后Western blot分析图，图4中，1.MCF7 细胞提取蛋白；2.免疫沉淀复合物；3.单克隆抗体；4.未加单克隆抗体的免疫 沉淀复合物。由图4可知，单克隆抗体与MCF7提取蛋白在分子量大约为20 000处 出现l条清晰的带，同时与其免疫沉淀形成的抗原-抗体复合物，分别在分子量 大约为20 000、 55 000、 25 000处出现3条清晰的带，分别与hAG-2、 IgG的重链 及轻链分子量相符；纯化后的抗hAG-2单克隆抗体作为抗原虽不能与一抗即制备 的单克隆抗体结合但可与二抗即服P-山羊抗小鼠IgG结合而显色，因而在分子量 大约为55 000和25 000处出现2条清晰的带，与抗体重链及轻链分子量相符，可 知，该单克隆抗体可与天然状态的hAG-2蛋白结合，并且亲和力高。
权利要求
1、一种杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株18A4，保藏号为CCTCC—C200902，其能分泌hAG2单克隆抗体。
2、 一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤步骤一，在pMal-c2载体中原核表达hAG2蛋白；步骤二，利用步骤一得到的hAG2免疫4-12周龄BALB/c雌性小鼠，得到免疫 后的小鼠；步骤三，将HAT培养液注入正常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部后回抽腹腔内液体， 离心，在沉淀下来的滋养细胞中加HAT培养液，注入96孔培养板进行培养；步骤四，将步骤二得到的免疫后的小鼠处死，消毒，取小鼠脾脏制成脾细胞 悬液，经静置、离心、稀释、计数、RPMI-1640基础培养液洗涤，得到小鼠脾细 胞；步骤五，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心，弃去上清液，加入 RPMI-1640基础培养液，离心，留下沉淀；步骤六，在沉淀中加入HAT培养液，混匀后注入步骤三中的96孔培养板进行 培养；步骤七，检测96孔培养板中的融合细胞，冲洗下阳性杂交瘤细胞，培养，选 取阳性杂交瘤细胞，反复培养杂交瘤细胞100%的分泌hAG2单克隆抗体为止，得 到稳定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3、 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤二中， 所述免疫具体为，加弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2注射进小鼠背部 和腹腔，注射hAG2的剂量为0. lmg，进行首次免疫，首次免疫3周后进行加强免 疫，每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量同首次免疫，加强免疫 用弗氏不完全佐剂，直至抗体滴度^1 : 10000，然后静脉注射未乳化的hAG2进行 冲击免疫，冲击免疫3天后小鼠可用于步骤四。
4、 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤五中， 所述混合具体为，脾细胞与骨髓瘤细胞按(3 5): 1的个数比例进行混合。
5、 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤五中， 所述加入RPMI-1640基础培养液具体为，在弃去上清液之后，弹动离心管使细胞 沉淀形成糊状，在37'C水浴条件下进行如下、操作，水浴2min,然后在lmin内加 入lraL PEG4000，边加边摇动离心管，之后摇动45s，然后分4次在7min内加入 RPMI-1640基础培养液26mL，第一次lmin内加入lmL RPMI-1640基础培养液，第 二次2min内加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640 基础培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，边加培养液边摇 动离心管；其中，RPMI-1640基础培养液为RPMI-1640培养液中加100U/ml青霉 素-链霉素。
6、 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤六中， 所述培养具体为，37-C、 C02体积浓度为5%、饱和湿度，培养3-5天后用HAT培 养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20 天用RPMI-1640完全培养液半量换液；其中，RPMI-1640完全培养液为RPMI-1640 基础培养液中加体积分数为10%的胎牛血清；HT培养液为RPMI-1640完全培养 液中加1X10—4M的次黄嘌呤以及1.6X10—5M的胸腺嘧啶；HAT培养液为HT培养 液中加4X10—7M氨基喋呤。
7、 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤三和步 骤七中，所述培养具体为，37°C、 0)2的体积浓度为5%、饱和湿度。
全文摘要
一种生物技术领域的杂交瘤细胞株及其制备方法，制备杂交瘤细胞株具体为表达hAG2蛋白；免疫小鼠；制备滋养细胞；制备小鼠脾细胞；将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合；细胞融合及培养；检测融合细胞，选取阳性杂交瘤细胞，反复克隆培养，得到杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C200902。用上述杂交瘤细胞注射小鼠，收集腹水，离心，收集上清液，纯化、鉴定即得hAG2单克隆抗体。本发明的杂交瘤细胞株可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体，本发明的hAG2单克隆抗体滴度达1×10<sup>-6</sup>，能与天然及变性的hAG2蛋白结合，且抗原表位位于hAG2蛋白的表面。
文档编号C12N5/20GK101519649SQ20091004596
公开日2009年9月2日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者奇 朱, 李大伟, 杲光伟, 武正华 申请人:上海交通大学