专利名称：一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及重组病毒载体。更具体地说，本发明涉及一类携带外源基因在
包装细胞中高效生产的的重组病毒载体、其构建方法及其用途。
背景技术：
病毒对特定细胞感染率高，可高效地将外源基因转导到细胞内，并长时间 表达，常作为基因转移的工具介导外源基因在靶细胞中的超量表达，通过功能获得 (gain-of-fimction)的方式研究基因的功能。另一方面，病毒也是基因治疗最常用的载体， 截止2008年9月，世界上已有1472个基因治疗方案用于临床试验，其中共1006项临床试验 采用不同种类的病毒作为载体，占总数的68. 3% (参见数据库http:〃www. wiley. co. uk/ ge歷ed/clinica1/)。 重组病毒的包装与扩增需要合适的包装细胞系，如293细胞，即含有5型腺病毒E1 区的人胚肾细胞，常用于重组腺病毒、腺相关病毒的包装与生产；293T及293FT细胞(293T 的快速生长变种)，由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，常用于重组慢病毒的包装与 生产；GP293细胞，由293细胞派生，同时表达Gag-po1蛋白，常用于逆转录病毒的包装与 生产。携带外源基因的重组病毒可在包装细胞中组装或复制增殖，促使重组病毒基因组中 包含的外源基因大量扩增与表达。然而， 一方面过量表达的外源基因对细胞具有一定的毒 性，尤其是自杀基因，细胞凋亡基因，细胞周期相关基因等，导致病毒包装细胞提早死亡，縮 短了重组病毒各功能基因在包装细胞中转录与翻译的时机，并导致部分病毒颗粒来不及组 装；另一方面，外源基因的大量转录与翻译也会占用细胞过多的RNA转录、蛋白质翻译相关 的酶类与资源，从而间接抑制了重组病毒各功能基因的转录与翻译。两个方面的影响降低 了重组病毒在包装细胞中的生产效率，无法获得足够的病毒滴度。 因此，为使携带外源基因的重组病毒获得较高的病毒滴度，非常需要能在包装细 胞中进行高效生产重组病毒的方法。 微小RNA (microRNA)是生物体内源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3'非 翻译区中的靶位点核苷酸序列结合，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特 异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大，因而可借助微小RNA的调控机制以 及表达组织特异性，利用病毒包装细胞高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA 调控外源基因的表达，使外源基因在包装细胞中不表达，提高病毒生产效率和滴度，而在靶 细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原有的治疗效果或通过功能获得的方式研究外源 基因功能。
发明概述 本发明提供了一种重组病毒载体，其特征在于该病毒可操作地连接的外源基因的 3'非翻译区中插入至少一个下述微小RNA(microRNA)的耙位点核苷酸序列，所述微小RNA 在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。
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在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒 (Adeno-associated virus)、反转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病 毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Poxvirus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)、 艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus)、人乳突状瘤病毒(Human Papillomavirus)、杆状 病毒(Baculoviruses)、黄病毒(Flavivirus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、新城疫病毒 (Newcastle disease virus) 、 Semliki森林病毒(Semliki forest virus)、仙台病毒 (Sendai virus)、猿猴病毒40 (Simian virus 40)禾口 a-病毒(Alphaviruses)中的至少一 种。所述病毒优选选自腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒、痘苗病毒，更优选所述病 毒选自腺病毒。 在一个实施方案中，所述病毒可操作地连接的外源基因选自细胞凋亡基因、前药 转换酶基因、细胞周期相关基因、细胞因子基因、信号转导基因、转录因子基因、癌基因、抑 癌基因、血管抑制基因、抗体基因(包括全长抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fv片段)、疫苗基因 中的至少一种。优选所述基因选自细胞凋亡基因、前药转换酶基因、抑癌基因、血管抑制基 因、抗体基因、疫苗基因，更优选所述基因选自细胞凋亡基因与抗体基因。
在一个实施方案中，所述病毒靶细胞可以选自心肌细胞、骨骼肌细胞、成纤维细 胞、血管内皮细胞、肝细胞、淋巴细胞、神经细胞、脂肪细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、肿瘤 细胞中的至少一种。所述靶细胞优选选自肝细胞、肿瘤细胞。 在本发明的一个实施方案中，所述微小RNA耙位点序列由1个或多个以上相同的 微小RNA耙位点序列以串联重复的方式构成。其中，微小RNA耙位点序列的单元个数为100、 90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个，1-7个， 1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。 在一个实施方案中，所述微小RNA耙位点序列由1个或多个以上不同的微小RNA 靶位点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。其中，微小RNA靶位点序列的单元个数分 别为100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个， 1-7个，1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。在一个实施方案中，所述病毒包装细胞选自293，293T，293FT，293E，293ET，293KB， 293Eco， GP293和FIP293中的至少一种。所述包装细胞优选选自293，293FT。
在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列选自miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a，miR-19b和miR-196a中的至少一种。所述微小RNA耙位点序列优选选自miR-15a， miR-18a， miR-16。 在本发明的一个实施方案中，所选用的病毒为人类腺病毒载体，其包括A、 B、 C、 D、 E及F6个亚属。 在本发明的一个实施方案中，所选用的腺病毒载体来源于人类C亚属5型的腺病毒。
在一个实施方案中，本发明还涉及重组病毒载体的构建方法，其特征在于在所述 病毒载体可操作地连接的外源基因的3'非翻译区中插入了至少一个下述微小RNA的靶位 点核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。
在一个实施方案中，所述的重组病毒用于使重组病毒可操作地连接的外源基因不 在病毒包装细胞中表达，而在靶细胞中正常表达。在一个实施方案中，所述重组病毒用于抑] 附图简述
图1 :pPE3-Fll的载体图谱。主要由pBHGlox(delta)El，3Cre改造而成，El区 缺失，可与包含腺病毒左臂的质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒；包含来源于 pBHGE3的E3区，其5型纤毛蛋白基因被5/11 fiber替换。 图2 :表示病毒载体Adll-RTX与Adll-RTX-15T在HEK293细胞中的复制能力比较结果。 图3 :表示Rituxan在HEK293与L02细胞中的表达量分析结果。
图4 :表示对照组与治疗组小鼠不同时间段移植瘤体积统计分析结果。
发明详述 如上文所述，本发明涉及一种重组病毒载体，其特征在于该病毒可操作地连接的 外源基因的3'非翻译区中至少包含一个病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或 低表达的微小RNA(microRNA)的耙位点核苷酸序列。 微小RNA(microRNA， miRNA)是生物体内源，长度约为19_25个核苷酸的非编码小 RNA，它通过与耙基因mRNA上的耙序列互补配对结合，在转录后水平上对基因的表达进行 负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制(Lai，2002)。据估计，在人类基因组中存在约1000个 miRNAs，大多数微小RNA位于基因间隔区或蛋白编码基因的内含子区，少数位于外显子区 或者mRNA非翻译区。大部分微小RNA单独存在，部分微小RNA聚集在一起，成为一个微小 RNA基因簇。生物信息学数据显示，人类约1/3的蛋白编码基因受微小RNA的调控，每个微 小RNA可以调节100-200个耙基因，而多个微小RNA可调节同一个基因，组成了一个复杂的 调控网络(Berezikov et al. ，2006)。 微小RNA在物种进化中相当保守，只在特定的组织和发育阶段表达，具有高度的 组织特异性和时序性。如miR-1和miR-133在心脏和骨骼肌组织中特异表达，miR-1可调 控心肌细胞在分化与增殖之间的平衡，而miR-133可调控肌肉细胞的分化，其表达下降可 以促进斑马鱼鱼鳍的再生；miR-122在人和小鼠的肝脏中高量特异表达，其含量可占肝脏 所有miRNA的70% ;miR_126在心、肺内皮细胞中特异表达，可抑制淋巴细胞与内皮细胞的 相互作用，防止血管炎症的发生；miR-142、 miR-181、 miR-223在造血组织中特异表达，其中 miR-181在小鼠胸腺细胞发育的CD4+CD8+双阳性期特异性表达，调控B细胞的成熟，miR-223 在骨髓中表达高，可调控粒细胞的成熟；miR-143在脂肪组织中特异表达，能调控脂肪细胞 的分化，敲除miR-143将导致甘油三酯的累积;miR-371-373簇(包括miR-271， miR_272， miR-273)在人的胚胎中特异表达，而mir-290-295簇(包括miR-290， miR_291， miR_292， miR-293，miR-294，miR-295)则在小鼠的胚胎中特异表达，它们在胚胎干细胞的分化过程中 起重要作用；miR-375在鼠胰岛细胞中特异表达，调控胰岛细胞发育和胰岛素分泌，另外， miR-375还在斑马鱼脑下垂体高效表达，调节其他激素和神经内分泌产物的分泌(参见综 述Landgraf et al. ，2007)。 在293系列细胞中表达水平较高的微小RNA有miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b， miR-196a(参见微小RNA数据库http://www. microrna. org/microrna/ get ExprForTissues. do tissue = hsa_Kidney_embryo_HEK293+)。 其中miR-15a与 miR-16紧密相邻，位于人基因组13ql4区，属于同一微小RNA簇；miR_17、 miR-18a与
5miR-19b紧密相邻，位于人基因组13q31区，属于miR-17-92簇；miR-196a在人基因组中有 两个拷贝，其中miR-196a-l位于第17染色体，而miR-196a_2位于第12染色体。除在293 系列细胞中较高水平表达外，miR-15a与miR-16在多种T细胞、B细胞中也有较高的表达 量，而在65X的B细胞慢性淋巴型白血病(CLL)病人，50%的套细胞淋巴瘤病人，16-40%的 骨髓瘤病人，60%的前列腺癌病人中均有13ql4区的缺失，导致miR-15a与miR-16基因的 丧失(Calin et al. ，2005) ;miR-17、miR-18a与miR-19b所在的基因组13q31区在散布的 B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常发生位点的扩增，导致其表达异常 上调(He et al. ，2005) ;miR-196a在乳腺癌细胞系MCF7中表达水平较高。以上微小RNA 在心、肺、肝、脾、卵巢、子宫、前列腺、甲状腺等器官组织中表达水平水平较低或不表达。
在本发明应用包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA的 耙位点核苷酸序列插入重组病毒基因组中包含的外源基因的3'非翻译区，从而使外源基因 不能在包装细胞内合成蛋白，并不影响重组病毒在包装细胞中的正常包装与增殖，从而提 高重组病毒的生产效率，提高病毒滴度。而在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原 有的治疗效果或通过功能获得研究外源基因功能。 "重组病毒，，包括腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus)、 反转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)、牛痘病毒 (Poxvirus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barrvirus)、 人乳突状瘤病毒(Human Papillomavirus)、杆状病毒(Baculoviruses)、黄病毒 (Flavivirus)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Neweastle disease virus)、 Semliki森林病毒(Semlikiforest virus)、仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒 40(Simianvirus 40)禾P a -病毒(Alphaviruses)。"包装细胞"是指用于病毒重组、扩增的 细胞系，它可以是从天然细胞中培育出的可稳定传代的细胞系，也可以是经改造的其基因 组中包含病毒包装必需基因的细胞系。如293细胞可用于腺病毒的重组与扩增。
"靶细胞"是指重组病毒的目标感染细胞，既可以是功能缺损或紊乱，需重组病毒 携带外源基因进行校正的细胞，也可以是功能正常，适宜于重组病毒感染后表达外源基因， 研究外源基因功能的细胞。"包装细胞中高水平表达而耙细胞中不表达或低表达的微小RNA"是指在包装细 胞与靶细胞之间表达水平差异大的微小RNA，即在包装细胞表达水平高，而在靶细胞表达水 平低或无。如miR-15a，它在293细胞中表达水平高，而在正常人肝细胞系L02表达水平极 低。通常，所述的"低表达"是指与包装细胞相比，耙细胞中微小RNA表达量不足包装细胞 的1/3。"微小RNA的靶位点核苷酸序列"是指微小RNA可与之结合从而发挥调控作用的
DNA序列。它既可以是与成熟微小RNA完全反向互补配对的DNA序列，也可以是已知的微小
RNA耙基因中与微小RNA结合，与微小RNA不完全反向互补配对的DNA序列。"外源基因"是指重组病毒基因组中包含的但不属于野生型病毒基因组的蛋白编
码基因，它可以是人类或其它物种的天然蛋白编码基因，也可以是人工合成的蛋白编码基因。"外源基因的3'非翻译区"是指外源基因成熟mRNA中编码序列下游不翻译的区 域，它位于外源基因终止密码子和polyA尾之间。
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"相同微小RNA耙位点序列的串联重复"是指2个以上相同微小RNA耙位点序列不 间隔的首尾相连，或者2个以上相同微小RNA靶位点序列首尾相连但中间相隔若干个核苷 酸序列。"不同微小RNA靶位点序列连续串联"是指一种微小RNA靶位点序列串联重复后连 接另一种微小RNA靶位点序列的串联重复。不同微小RNA靶位点序列间隔串联是指一种微 小RNA靶位点序列后连接另一种微小RNA靶位点序列，并以此为单元重复2次以上。
在本发明的一个实施方案中，包装细胞选自人肾胚HEK293细胞系，及从HEK293中 衍生培育出的其它细胞系，如293T， 293FT，293E，293ET， 293KB, 293Eco， GP293, FIP293等。
在本发明的一个实施方案中，所述微小RNA耙位点核苷酸序列可以选自293系列 细胞中高水平表达的miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b， miR-196a中的至少一 种。 在本发明中中还例示性地公开了采用本发明的设计策略的重组腺病毒载体、其构 建方法以及所述重组腺病毒的实际用途。例如通过在携带全长美罗华Rituxan全长抗体 基因的的3'非翻译区插入5个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段，使该含有外源基因 美罗华的重组腺病毒在包装细胞293中获得高滴度，而且通过该方法扩增的病毒感染靶细 胞_肝细胞后，可以有效地在肝细胞中表达有活性的Rituxan抗体，并使之分泌到细胞外， 最终作用于CD20阳性的肿瘤细胞，导致肿瘤细胞死亡。 在本发明中还例示性地公开了采用本发明的设计策略的重组慢病毒载体、其构建 方法以及所述重组慢病毒的实际用途。例如通过在重组慢病毒可操作地连接的人P53基因 的3'非翻译区插入4个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段，使之在包装细胞293FT细胞 中获得了高滴度的重组慢病毒。 与现有重组病毒载体相比，本发明具有如下有益效果 本发明在重组病毒载体可操作地连接的外源基因的3'非翻译区中插入至少一 个包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA的靶位点核苷酸序列， 使外源基因不能在包装系列细胞中随着病毒的复制而大量表达，避免了外源基因过量表 达造成的细胞毒性及对细胞转录、翻译相关酶类和资源的竞争，提高了重组病毒的生产效 率和病毒滴度。而在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原有的治疗效果或通过 gain-of-function研究外源基因功能。 本发明中的实施例仅用于例示性说明本发明的具体实施方案，其不限制本申请的 保护范围，任何本领域技术人员可以根据现有技术进行的等价的改良都包含在本申请的保 护范围之内。
具体实施例方式
— .实施例1 :携带美罗华(Rituxan)基因并可在293细胞中高效生产的重组腺 病毒载体的构建 1.携带美罗华(Rituxan)基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建
pDC315载体购于力B拿大Microbix Biosystem Inc. (Toronto)，含有5型腺病毒左 臂El区1417至2344bp序列片段，及反向末端重复序列(ITR)，可以与包含腺病毒右臂的 骨架质粒发生同源重组，获得复制缺陷型腺病毒。pDC315载体经酶切改造，替换mCMV启动子，连接EFla (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha)启动子及内含子、 新的多克隆位点，保留原有的SV40 PolyA信号序列，命名该载体为pDC338。应用多聚酶链 反应(PCR)技术分别扩增美罗华(Rituxan)基因轻链、重链基因序列，并用核糖体进入位点 序列(IRES)连接轻重链基因，命名为pDC338-RTX。
NO :1) 引物2 :TGCGTCGACTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAA(SEQ ID NO :2) NO :3) 引物4 :CCCGCTAGCTTACTATTTACCCGGAGACAGGGA(SEQ ID NO :4)
应用引物3和引物4扩增，获得720bp的轻链基因，首尾分别加入EcoRI和Sail 酶切位点，应用引物5和引物6扩增，获得1431bp的重链基因，首尾分别加入BamHI和Nhel 酶切位点。EFla启动子至SV40 PolyA信号之间序列的测序结果(5' -3')如下<image>image see original document page 9</image>
合成包含5个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段(5XmiR-15T)，并在5'-末端 与3'-末端分别加入Nhel和Spel的酶切位点，该DNA片段由上海生工生物工程技术有限公 司进行全长基因合成。经测序正确，命名为pUC57-miR-15T，其核苷酸序列如下(5' -3'):CCATTATGTGCTGCTAACTAGT(SEQ ID NO :6) 利用Nhel和Spel双酶切pUC57-miR-15T质粒，回收146bp的5XmiR-15T片段， 将其插入pDC338-RTX载体的美罗华基因的3'非翻译区(重链基因后，SV40 Poly A加尾 信号前)，命名为pDC338-RTX-15T。 3.携带美罗华(Rituxan)基因并受miR-15a调控的复制缺陷型腺病毒的重组
HEK293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc. (Toronto)，是由剪切的5型 腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒El区，腺病毒DNA对其具有 高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细 胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pDC338-RTX和pDC338_RTX_15T分 别与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11通过Lipofectamine共转染至293细株，其具 体方法参见GIBC0 BRL公司的操作说明。pPE3-F11由pBHGlox (delta) El， 3Cre改造而成， El区缺失，可与包含腺病毒左臂的穿梭质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒，含有 来源于pBHGE3的E3区，其5型纤毛蛋白基因被5/11fiber替换，具体载体图谱见附图1。 pBHGlox (delta) El ， 3Cre与pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc. (Ontario)。共 转染后9-14天出现腺病毒空斑，经过三次腺病毒空斑纯化，即得携带Rituxan全长抗体基 因的重组腺病毒和携带Rituxan全长抗体基因并受miR-15a调控的重组腺病毒，分别命名 为Adll-RTX和Adll-RTX-15T(CCTCC-V200813，2009年1月9日，中国典型培养物保藏中 心)。 腺病毒在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒。
4.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组 腺病毒在HEK293细胞中的复制能力比较 将HEK293细胞株按5X 105细胞/孔铺在6_孔板中，在37。C孵箱5% C02培养，第 二天换无血清培养基lml，然后，分别加入重组腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺病毒 量为MOI = 5，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，并加入5%胎 牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测腺病毒 滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)，结果发现在HEK293中的腺病 毒复制能力Adll-RTX-15T是Adll-RTX的100倍(见图2)。表明miR-15aT靶位点核苷酸 序列的插入可显著提高重组腺病毒的生产效率。 5.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组 腺病毒在HEK293细胞中表达Rituxan的能力比较 将HEK293细胞按1 X 105细胞/孔铺在24-孔板中，在37 。C孵箱5 % C02培养。 第二天分别加入重组腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺病毒量为M01 = 5，两小时后 洗去病毒。分别在3天与7天后收集细胞，应用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbentassay， ELISA)检测上清中Rituxan抗体的表达水平，结果发现在第3
天，Adll-RTX与Adll-RTX-15T感染HEK293细胞后抗体的浓度分别为2. 19±0. g/ ml，O. 31±0. liig/ml。在第7天，Adll-RTX与Adll-RTX_15T感染后抗体的浓度分别为 3. 43±0. 3ii g/ml，0. 39±0. 2 ii g/ml。可见在各个时间段，Adll-RTX与Adll-RTX_15T感染 HEK293细胞后Rituxan蛋白的表达水平Adl l-RTX-15T均远低于Adl l-RTX，分别降低了 7. 0 倍和8. 8倍(见图3)。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入可使外源基因在病毒包装细 胞293中的表达变化显著下降。 6.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组 腺病毒在正常肝细胞中表达抗体效率比较 人正常肝细胞株L02 miR-15a表达阴性，将其按1乂105细胞/孔铺在24-孔板 中，在37"孵箱5% C02培养。第二天分别加入重组腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺 病毒量为MOI = 5，两小时后洗去病毒。分别在第3天和第7天收集细胞，应用酶联免疫吸 附剂测定(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)检测抗体的表达水平，结果发现 在第3天，Adll-RTX与Adll-RTX-15T感染L02细胞后抗体的浓度分别为1. 55±0. 1 y g/ ml，1.67士0. 2iig/ml。在第7天，Adll-RTX与Adll-RTX-15T感染后抗体的浓度分别为 3. 21±0. 4ii g/ml，3. 35±0. 2 ii g/ml。可见在各个时间段，Adll-RTX与Adll-RTX-15T感染 肝细胞L02后Rituxan蛋白的表达水平相似(见图3)。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的 插入未引起外源基因在靶细胞中的表达变化。 7.携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤
将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种CD20阳性的Raji细胞株1 X 107，两周后， 一次 给予荷瘤小鼠尾静脉注射携带Rituxan基因的重组腺病毒Adll-RTX，以及携带Rituxan基 因并受miR-15a调控的重组腺病毒Adll-RTX-15T，剂量各为5 X 108pfu，统计肿瘤体积的随 时间的变化情况。结果发现，其未治疗组3周后肿瘤体积增加3倍以上，而治疗组可显著縮 小肿瘤的大小，且重组腺病毒Adll-RTX与Adll-RTX-15T抑制肿瘤生长的作用无显著差异 (见图4)。表明在动物体内miR-15a靶位点核苷酸序列的插入未降低治疗效果。
二 .实施例2 :携带人P53基因并可在293FT细胞中高效生产的重组慢病毒的构 建 1.包含人P53基因的慢病毒包装用表达质粒的构建 pKCDNA-CMV—EFla-GFP质粒购于康成生物公司，它含有EFla启动子控制下的 GFP基因的表达盒，外源基因可以在CMV启动子的控制下表达。提取人总RNA，应用逆转录 酶合成单链cDNA，并应用多聚酶链反应(PCR)技术从单链cDNA文库中扩增出人P53基因的 开放阅读框。命名为pKCDNA-P53。 引物5 :CCGTCTAGAACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGA(SEQ ID NO : 7)
引物6 :TGCGAATTCTCAGTCTGAGTCAGGCCC(SEQ ID NO :8) 引物5与引物6扩增获得1197bp的P53基因的编码区序列，首尾分别加入Xbal 和NheI酶切位点。其测序结果(5' -3')见下::0144]:0145]:0146]:0147]:0148]:0149]
:0150]:0151]
:0152]:0153]:0154]:0155]:0156]:0157]:0158]ACTCAGACTGAGCTAGC(SEQ ID NO :9) 2.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒包装用表达质粒的构建
合成包含4个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段(4XmiR-15T)，并在5，-末端与3'-末端分别加入Nhel和EcoRI的酶切位点，该DNA片段由上海生工生物工程技术有限公司进行全长基因合成，并经测序验证正确。将4XmiR-15T片段插入pKCDNA-P53载体的人P53基因的3'非翻译区(终止密码子后，SV40 Poly A加尾信号前)，命名为pKCDNA-P53-15T。 4XmiR-15T片段的核苷酸序列如下(5， -3， ) :GCTAGCCACAAACCATTATGT
TGCTGCTAGAATTC(SEQID NO :10) 3.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒的包装重组 将293FT细胞按7. 5X1()5铺在10cm dish上，5 % C02培养箱过夜培养。第二天将10 % DMEM培养基换成2 %的DMEM培养基，4小时后将20 y g表达质粒(pKCDNA-P53与pKCDNA-P53-15T) ， 10 y g包装质粒pCMVdelta8. 91与5 y g包装质粒pMD. G混合，加无菌水至250 ii 1，震荡混匀。向上述混合液中依次加入250 iil的0. 5MCaCl2，而后向上述混合液中逐滴加入500 ii 1的2XHBS，边加边震荡。静置30分钟，将上述混合液均匀加入细胞培养基中。转染后12小时，倒掉2XDMEM培养基，PBS清洗两遍，换回10% DMEM培养基，分别在36小时，60小时后收取细胞培养基。将收集含有病毒颗粒的细胞培养基以4000g离心10min，收集上清液，并用0. 45 ii m滤器过滤，滤过的液体置于40mL超速离心管中，4°C ， 25000r/min离心20分钟，使用500ul冰PBS液重悬病毒沉淀。包装获得的携带人P53基因的慢病毒，以及携带人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒分别命名为Le_P53和Le-P53-15T。
4.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒的滴度测定 在六孔板中按2x107孔铺Hela细胞，使用10% DMEM培养基培养，置于5% C02培养箱过夜。将待测病毒(Le-P53和Le-P53-15T)梯度稀释为10—2_10—6倍，将每个浓度的病
12毒液稀释于2XDMEM培养基，终体积为lml。稀释完成后，将六孔板中原先的培养基倒掉，换成加入病毒稀释液的培养基，置于5% (A培养箱过夜培养。第二天将含有病毒的2%DMEM培养基换成10% DMEM培养基，感染后第四到五天，用PBS清洗细胞，消化后重悬，经流式细胞仪检测荧光表达情况，计算公式病毒滴度(TU/mL)=细胞数量1荧光阳性细胞的百分比/病毒液体积(ml)。流式细胞仪测定表明Le-P53-15T的病毒滴度为8. 75xl09TU/mL，而Le-P53的病毒滴度为1. 37xl08TU/mL，Le-P53-15T的病毒滴度是Le_P53的64倍。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入可显著提供重组慢病毒在包装细胞293FT的病毒滴度。
5.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒在肿瘤细胞中表达P53的水平测定
肝癌细胞株H印3B，肺癌细胞株A549，乳腺癌细胞株MCF7购于ATCC，miR-15a表达均为阴性。将上述肿瘤细胞按5X 104细胞/孔铺在24-孔板中，在37t:孵箱5% C02培养过夜。第二天分别加入重组慢病毒Le-P53、Le-P53-15T，M01值为10。分别在第1、2、3天，提取总RNA，应用引物7与引物8，通过实时定量RT-PCR的方法检测P53的表达水平。结果发现在各个时间段，Le-P53与Le-P53-15T表达P53的水平无显著差异。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入未引起靶细胞中外源P53的表达量变化。
引物7 :GCGCACAGAGGAAGAGAATC(SEQ ID NO : 11)
引物8 :CAAGGCCTCATTCAGCTCTC(SEQ ID NO :12) 通过上述试验证明，本发明的重组病毒在包装细胞中具有更高的增殖效率或生产
效率，而在靶细胞中不影响外源基因的表达水平。 参考文献: 1. Lai EC. MicroRNAs are complementary to 3' UTR sequencemotifs thatmediate negative post-transcriptional regulation. Nat Genet. 2002 ;30 (4) :363-4
Berezikov E， Cuppen E， Plasterk R.Approaches tomicroRNAdiscovery. NatGenet. 2006,38(6) :2-6 2丄andgraf P，Rusu M， Sheridan R， Sewer A， Iovino N， AravinA，Pfeffer S，RiceA，Kamphorst A0，Landthaler M，Lin C，SocciND，Hermida L，Fulci V，Chiaretti S，FodR，Schliwka J， FuchsU， Novosel A， M iiller RU， Schermer B， Bissels U， Inman J， PhanQ，Chien M，Weir DB，Choksi R，De Vita G，Frezzetti D，TrompeterHI，Horhung V，Teng G，Hartmann G，Palkovits M，Di Lauro R，Wernet P，Macino G，Rogler CE，Nagle JW，Ju J，Papavasiliou FN， Benzing T， Lichter P， Tam W， Brownstein MJ， Bosio A， BorkhardtA，Russo JJ，Sander C，Zavolan M，Tuschl T. A mammalian microRNAexpression atlas basedon small RNA library sequencing. Cell. 2007 ;129 (7) :1401-14 3. Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， Di Leva G， Shimizu M， Wojcik SE， IorioMV，Visone R，Sever NI，Fabbri M， luliano R，Palumbo T，Pichioiri F， Roldo C，GarzonR， Sevignani C， RassentiL， Alder H， Volinia S， Liu CG， Kipps TJ， Negrini M， CroceCM. A MicroRNA signature associated with prognosis and progressionin chroniclymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2005 ;353 (17) :1793-801 4. He L， Thomson JM， Hemann MT， Hernando-Monge E， Mu D， Goodson S， PowersS， Cordon—Cardo C， Lowe SW， Harmon GJ， HammondSM. A microRNA polycistron as apotential human oncogene. Nature. 2005 ;435(7043) :828_33
2401
2461
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肌gttC3肌g gC肌ggCC3C 3ttg3CtgC3 g3C3肌tCCtCC3gC3C3gC Ct3C3tgC3g
ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagatc gacttactac
ggcggtgact ggtacttcaa tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctctgcagcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
3tctgC肌Cg tg肌tC3C肌 gCCC3gC肌C 3CC肌ggtgg 3C肌g肌3gt tgagccc肌3
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag taagctagca ctagtctcga cttcgagcaa3541 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 3601 taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 3661 tcatgtctgg atcgtctagc atcgaagatc c 3691 〈210〉6 〈211〉140 〈212>DNA 〈213>pUC57-miR-15T 〈400>6 gctagccaca aaccattatg tgctgctaga tccacaaacc attatgtgct gctaacgatc 60 acaaaccatt atgtgctgct actccacaaa ccattatgtg ctgctacgat cgcacaaacc 120 attatgtgct gctaactagt 140 〈210〉7 <211>32 〈212>DNA 〈213〉引物5 〈400〉7 ccgtctagaa ccatggagga gccgcagtca ga 32 <210>8 〈211〉27 〈212〉DNA 〈213〉引物6 〈400>8 tgcgaattct cagtctgagt caggccc 27 〈210〉9 〈211>1197 〈212>DNA 〈213>P53 〈400〉9 tctagaacca tggaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa 60
18acattttcag acctatggaa actacttcct gaaaacaacg ttctgtcccc cttgccgtcc
c肌gc肌tgg at gat tt gat gctgtccccg gacgatettg 肌C肌tggtt C3Ctg33g3C
ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca gaggctgctc cccccgtggc ccctgcacca
gcagctccta caccggcggc ccctgcacca gccccctcct ggcccctgtc atcttctgtc
ccttcccaga aaacctacca gggcagctac ggtttccgtc tgggcttctt gcattctggg
acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc cctgccctca acaagatgtt ttgccaactg
gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc
cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag cacatgacgg aggttgtgag gcgctgcccc
caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt ctggcccctc ctcagcatct tatccgagtg
g肌gg肌3tt tgCgtgtgg3 gtetttggat g3C3g肌3C3 cttttcgaca tagtgtggtg
gtgccctatg agccgcctga ggttggctct gactgtacca ccatccacta caactacatg
tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac cggaggccca tcctcaccat catcacactg
g肌gactcca gtggt肌tct actgggacgg 肌cagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt
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gagctgcccc cagggagcac taagcgagca ctgcccaaca acaccagctc ctctccccag
cc肌3g^g3 肌ccactgg3 tggag肌tat ttcacccttc agatccgtgg gcgtgagcgc
ttcgagatgt tccgagagct g肌tgaggcc ttgg肌ctca 3ggatgccca ggctggg肌g
gagccagggg ggagcagggc tcactccagc cacctg肌gt cca肌肌ggg tcagtctecc
tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca gaagggcctg actcagactg agctagc
〈210〉10
19
〈211〉112〈212>DNA〈213〉4XmiR-15T〈400〉10gctagccaca aaccattatg
60acaaaccatt atgtgctg
112〈210〉11〈211〉20〈212>DNA〈213〉引物7〈400〉11g C g C 3 C 3
20〈210〉12〈211>20〈212>DNA〈213〉引物8〈400>12caaggcctca ttcagc tctc
gaagagaatc
20
权利要求
一种重组病毒载体，该载体可操作地连接有外源基因和微小RNA的靶位点核苷酸序列，其特征在于在该病毒载体可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入有至少一个下述微小RNA的靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。
2. 根据权利要求1所述重组病毒载体，其特征在于所述病毒选自腺病毒 (Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus)、反转录病毒(Retrovirus)、 慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)、牛痘病毒(Poxvirus)、单纯疱疹 病毒(Herpes simplexvirus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus)、人乳突状瘤病毒 (HumanPapillomavirus)、杆状病毒(Baculoviruses)、黄病毒(Flavivirus)、麻疹病毒 (Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus) 、 Semliki森林病毒(Semliki forest virus)、仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒40 (Simian virus 40)禾口a-病毒 (Alphaviruses)中的至少一禾中。
3. 根据权利要求1所述重组病毒载体，其特征在于所述病毒可操作地连接的外源基因 是编码选自细胞凋亡基因、前药转换酶基因、细胞周期相关基因、细胞因子基因、信号转导 基因、转录因子基因、癌基因、抑癌基因、血管抑制基因、抗体基因、疫苗基因中的至少一种。
4. 根据权利要求l所述重组病毒载体，其特征在于所述病毒载体包装细胞选自293， 293T，293FT，293E，293ET，293KB，293Eco， GP293和FIP293中的至少一种。
5. 根据权利要求4所述的重组病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶位点序列选自 miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b和miR-196a中的至少一种。
6. 根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶位点序列由1个 或多个相同的微小RNA靶位点序列以串联重复的方式构成。
7. 根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶位点序列由1个 或多个不同的微小RNA靶位点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。
8. 权利要求1所述重组病毒载体的用途，其用于使重组病毒可操作地连接的外源基因 不在病毒包装细胞中表达，而在靶细胞中正常表达。
9. 权利要求8的重组病毒载体用途，其特征在于所述病毒载体的靶细胞选自心肌细 胞、骨骼肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞、淋巴细胞、神经细胞、脂肪细胞、胚胎 干细胞、成体干细胞和肿瘤细胞中的至少一种。
全文摘要
本发明提供一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途。其特征在于在该病毒可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入有至少一个下述微小RNA的靶位点核苷酸序列所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。从而实现选择性地抑制外源基因在病毒包装细胞中的表达，避免外源基因对病毒包装与生产的负面影响，提高病毒的生产效率和滴度，同时在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，不影响治疗效果或研究外源基因的功能。
文档编号C12R1/93GK101787373SQ20091004599
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者吕赛群, 吴孟超, 李琳芳, 金华君, 钱其军 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院