专利名称：筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法
技术领域：
本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，涉及筛选含有外源融合基因 HIV/gag/IFNa-2b的重组痘苗病毒的方法。
背景技术：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS )是本世纟已以来对 人类威胁最严重的传染病。艾滋病病毒对人体免疫功能的破坏所产生的难 以治愈的感染和肿瘤已经威胁了人类社会的生存和发展。特别是艾滋病在 传播蔓延过程中一个最引人关注的现象是，全球艾滋病病毒新感染者中， 青少年占一半以上。目前，尚未有能从根本上彻底治疗和预防艾滋病的有 效药物。现行的各种治疗措施都是尝试性的。由于艾滋病主要是和免疫系 统有关的疾病，因而获得可靠的免疫预防保护是从根本上解决艾滋病流行 传播的关键。人获得性免疫缺陷病毒(HIV)作为反转录RNA慢病毒，是 传播AIDS的主要病原体。核心蛋白(gag)是HIV的主要结构蛋白之一。 gag蛋白能够诱导动物产生包括中和抗体的体液免疫和细胞免疫，并能够自 我装配形成病毒样粒子(Vims-like particle，VLP )。表面具有活化B细胞的 一级结构表位和诱发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，氨基酸序列相对 保守，是新型疫苗设计的理想区域。有关HIV疫苗的研制多数是围绕着外 膜蛋白(eiw)展开的，而本项发明利用HIV核心蛋白(gag)基因片段， 构建在真核细胞表达的融合基因。表达的蛋白产物即可作为抗原进行免疫 预防，又可作为诊断试剂筛查感染人群。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子生物学领域的操作技术，通过构建一个 基因重组表达质粒，筛选出一株含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒。
本发明是通过如下技术方案实现的
将编码人干扰素a-2b的基因序列与编码人HIV-lgag基因融合，构建读 框吻合的外源融合基因片断，并克隆到痘苗病毒表达载体pJ38中，构建了 含有HIV-lgag和IFNa-2b外源融合基因的重组表达质粒pJ38gag/IFNa-2b， 在真核细胞中忠实地翻译了原有的基因序列，连续稳定地表达了 gag/IFNa-2b融合蛋白，pJ38gag/IFNa-2b基因表达产物在体外能与 HIV-lgag阳性血清发生特异性反应，具备免疫原性和免疫反应性，无返祖 现象。为研究艾滋病病毒结构蛋白的的抗原性，提供了一个获得艾滋病病 毒核心蛋白的途径。为研究艾滋病感染者的检测诊断试剂与免疫预防治疗 提供重要的理论依据。 本发明的技术解决方案包括以下步骤 1. pJ38gag/IFNa-2b基因重组与鉴定
在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-7(TC超低温冰箱冻存，用 于转化质粒。采用CaCl2转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入五."//HBIOI、 JM109、 DH-5a、 JM101甲，在赏50昭/ml Amp的LB液体培界丞 中37"C振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有 目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用 限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位置 后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检 测260nm和280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置-20。C冰箱中 保存，备用于连接反应。DNA目的基因片断与载体的回收根据实验目的和 DNA分子量大小分别釆用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点 琼脂糖凝胶回收法与透析袋法。酶切DNA片段的3'凹端补平与线性质粒 DNA的5'端去磷分别釆用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶(CIP ) 分别置室温、37°C、 55°C、 75。C反应，将3'凹端补平与5'端去磷的线性质 粒DNA用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16。C水洛过夜或25°C lh。 进行连接反应。重组子的筛选和鉴定釆用酶切法。挑选酶切结果与理论预 计值相同者进一步用两种以上内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相 同者，即为目的重组质粒。结果构建了内含目的基因片段 gag/IFNa-2b(nt531-ntl507+nt336-ntll71+ntl507-nt1712)， 分子量约为 8.351kb的重组表达质粒pJ38gag/IFNa-2b。 2. pJ38gag/IFNa-2b在真核细胞中表达与鉴定
真核细胞表达是以野生型痘苗病毒为介导转基因，釆用脂质体转染细 胞法，使pJ38gag/IFNa-2b在细胞内与野生型痘苗病毒发生同源重组具体 操作是分别在35mm平皿中培养的RK、BHK21以及Cos-7细胞中感染野生 型痘苗病毒，感染MOI(Multiplicity of infection)为0.1的野生型病毒，于 37°C、 5%(202反应lh后与包裹脂质体的质粒进行共转染，同时设未感染病 毒的正常细胞和未加转染试剂的痘苗病毒感染细胞为对照。培养48h后， 以血凝素基因(HA)为报告基因，筛选纯化含目的基因pJ38gag/IFNa-2b的重 组痘苗病毒。本实验经加入预先处理好的鸡红细胞后镜下观察，由于野生 型病毒具有完整的HA基因，所以非重组病毒感染的细胞有HA基因蛋白表 达的血凝素而能吸附鸡红细胞。肉眼观察可见病毒蚀斑呈红色片状，光镜 下可见大量鸡红细胞被吸附在病变细胞的表面。重组病毒由于外源基因片 段的插入使HA失活，其感染的细胞不能表达血凝素，故丧失了吸附鸡红细 胞的能力。肉眼观察与非重组病毒蚀斑有明显差异，镜下观察无鸡红细胞 吸附，蚀斑内的细胞多数崩解、脱落，仅剩下少量细胞融合、拥挤成堆、 斑内形成空洞。结果利用HA特性，筛选纯化出vJ38gag/IFNa-2b重组痘苗 病毒株，经过3 4代的纯化直至稳定表达HA-斑为止，48h后收毒。以细胞 培养法扩增重组痘苗病毒，以间接免疫荧光分析(IFA)、 Dot-ELISA、 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与蛋白印迹(Western blotting)方法鉴 定pJ38gag/IFNa-2b目的基因在真核细胞中的表达产物，确定其分子量。结 果vJ38gag/IFNct-2b重组痘苗病毒株表达的Gag蛋白能被HIV-1血清所识 别，分别能与l: 10倍稀释后的HIV-lgag阳性血清发生较强的特异性呈色 反应，其分子量为60kDa，与预计理论上的计算值相符合。3. pJ38gag/IFNa-2b录达产物的兕提原性和兕叛反应性研究
将筛选纯化的vJ38gag/IFNa-2b重组痘苗病毒接种于体外培养的单层细 胞，培养约30h左右，收取感染细胞，测定病毒PFU值，调整病毒的滴度 使其达到108PFU,用弗氏佐剂制备样品，釆用足垫和腹腔两种免疫途径免 疫小鼠，加强免疫3次，饲养60天后，眼球取血，无菌制备脾淋巴细胞， 釆用HIV-1间接ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清HIV抗体，在DG5030型 酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的光密度值(OD49Q )。流式细胞仪 FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学分析。结果表明含有 pJ38gag/IFNa-2b基因的重组痘苗病毒株能表达目的蛋白。重组痘苗病毒表 达产物免疫小鼠后，体液免疫检测结果表明，重组痘苗病毒表达产物免疫 小鼠后可以激发小鼠体内产生高滴度的抗体水平，含IFNa-2b结构基因组与 不含IFNa-2b结构基因组之间比较，前者提高了重组颗粒化抗原的免疫原 性。流式细胞仪检测3000个T淋巴细胞中标记的阳性细胞表明小鼠体内产 生了细胞免疫。统计学分析，多组间比较作方差分析，组间比较用t检验。 t=x-^sx。重组病毒基因表达产物的生物活性研究釆用淋巴细胞转化实验与 CTL杀伤活性实验，结果表明，gag/IFNa-2b融合基因在痘苗病毒中共表达 产物能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫，具备免疫原性与免疫反应性。 本发明的实用意义艾滋病病毒对机体免疫系统的CD + 4 T淋巴细胞 具有强烈的嗜性， 一旦人体感染了艾滋病病毒，就会破坏机体内的CD"T 细胞，使CD"细胞数急剧下降，随之抗HIV中和抗体滴度和CTL数逐渐 下降，致使机体免疫力下降，病人出现严重的免疫缺陷综合症，导致各种 机会性感染和肿瘤，直至患者死亡。但HIV究竟以什么方式破坏人体的免 疫系统仍是一个没有解决的问题。因此，寻找使用艾滋病病毒中的哪种结 构蛋白才能作为有效保护性抗原是保护CD"细胞不受侵犯，抑制HIV在体 内扩散，达到从根本上有效治疗艾滋病的目的。另'一方面，艾滋病病毒的 最大特点是持续存在着潜伏复制转换和抗原性漂移，HIV作为RNA逆转录 病毒，它在自身复制过程中需要先由病毒基因组RNA反向转录为前病毒 DNA，再由前病毒DNA转录为病毒基因组RNA。逆转录病毒基因组由RNA 向DNA反向转录，再由DNA向RNA正向转录的过程均是由病毒本身的 RNA酶所催化。这种逆转录酶缺少核酸外切酶的活性，转录忠实性差，在 催化RNA反向转录过程中发生碱基错配，逆转录酶的无校正功能是HIV产 生变异的重要因素，也给HIV的药物治疗和免疫预防带来巨大的障碍。我 们的研究正是围绕上述两方面的问题展开的，为研究艾滋病感染者的检测 诊断试剂与基因免疫预防治疗提供了一个获得艾滋病病毒核心蛋白的途径 和重要的理论实验依据。
图1为重组表达质粒pJ38gag/IFN a-2b的构建
图2为重组质粒酶切鉴定
具体实施例方式
实施例1:重组表达质粒pJ38gag/IFN a-2b的构建(见附图1) 实施例2:
重组质粒酶切鉴定(见附图2)
权利要求
1. 筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法，其特征在于包括以下步骤①pJ38gag/IFNα-2b基因重组与鉴定在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-70℃超低温冰箱冻存，用于转化质粒，采用CaCl2转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101中，在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位置后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检测260nm和280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置-20℃冰箱中保存，备用于连接反应，DNA目的基因片断与载体的回收；分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法；酶切DNA片段的3’凹端补平与线性质粒DNA的5′端去磷分别采用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶分别置室温、37℃、55℃、75℃反应，将3’凹端补平与5′端去磷的线性质粒DNA用0.5weiss单位的T4 DNA连接酶置16℃水浴过夜或25℃ 1h；进行连接反应；重组子的筛选和鉴定采用酶切法；挑选酶切结果与理论预计值相同者进一步用两种以上内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者， 即为目的重组表达质粒pJ38gag/IFNα-2b；②pJ38gag/IFNα-2b在真核细胞中表达与鉴定真核细胞表达是以野生型痘苗病毒为介导转基因，采用脂质体转染细胞法，使pJ38gag/IFNα-2b在细胞内与野生型痘苗病毒发生同源重组具体操作是分别在35mm平皿中培养的RK、BHK21以及Cos-7细胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI为0.1的野生型病毒，于37℃、5％CO2反应1h后与包裹脂质体的质粒进行共转染，同时设未感染病毒的正常细胞和未加转染试剂的痘苗病毒感染细胞为对照；培养48h后，以血凝素基因为报告基因，筛选纯化含目的基因pJ38gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒；利用HA特性，筛选纯化出vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒株，经过3～4代的纯化直至稳定表达HA-斑为止，48h后收毒；以细胞培养法扩增重组痘苗病毒，以间接免疫荧光分析、Dot-ELISA、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白印迹方法鉴定pJ38gag/IFNα-2b目的基因在真核细胞中的表达产物，确定其分子量；③pJ38gag/IFNα-2b表达产物的免疫原性和免疫反应性将筛选纯化的vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒接种于体外培养的单层细胞，培养约30h左右，收取感染细胞，测定病毒PFU值，调整病毒的滴度使其达到108PFU，用弗氏佐剂制备样品，采用足垫和腹腔两种免疫途径免疫小鼠，加强免疫3次，饲养60天后，眼球取血，无菌制备脾淋巴细胞，采用HIV-1间接ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清HIV抗体，在DG5030型酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的光密度值(OD490)，流式细胞仪FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学分析。
2、 根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒的方法，其特征在于重组痘苗病毒vJ38gag/IFNot-2b表达产物为 将vJ38gag/IFNct-2b表达的蛋白产物以适当比例加入弗氏佐剂，制成具有刺 激机体产生免疫反应的蛋白抗原。
3、 根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒的方法，其特征在于所述的DNA目的基因片断与载体的回收 根据实验目的和DNA分子量大小分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电 泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法。，
4、 根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒的方法，其特征在于所述的重组表达质粒pJ38gag/IFNa-2b内含 目的基因片段gag/IFNa國2b(nt531-ntl507+nt336國ntll71+nt1507 -ntl712)，分 子量约为8.351kb。
5、 根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒的方法，其特征在于vJ38gag/IFNa-2b重组痘苗病毒株表达的 Gag蛋白能被HIV-l血清所识别，分别能与1: 10倍稀释后的HIV-lgag阳 性血清发生较强的特异性呈色反应，其分子量为60kDa。
6、 根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重组 痘苗病毒的方法，其特征在于含目的基因pJ38gag/IFNa-2b的重组痘苗病 毒经加入预先处理好的鸡红细胞后镜下观察，由于野生型病毒具有完整的 HA基因，所以非重组病毒感染的细胞有HA基因蛋白表达的血凝素而能 吸附鸡红细胞。肉眼观察可见病毒蚀斑呈红色片状，光镜下可见大量鸡红 细胞被吸附在病变细胞的表面。重组病毒由于外源基因片段的插入使HA 失活，其感染的细胞不能表达血凝素，故丧失了吸附鸡红细胞的能力。肉 眼观察与非重组病毒蚀斑有明显差异，镜下观察无鸡红细胞吸附，蚀斑内 的细胞多数崩解、脱落，仅剩下少量细胞融合、拥挤成堆、斑内形成空洞。
全文摘要
本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，提供了筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法。本方法根据HIV核心蛋白氨基酸序列相对保守，具有活化B细胞的一级结构表位和活化杀伤T细胞作用的原理，构建了重组表达质粒pJ38gag/IFNα-2b，采用脂质体转染法，以野生型痘苗病毒为介导转基因，使pJ38gag/IFNα-2b与野生型痘苗病毒发生同源重组，利用HA特性，筛选纯化出vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒株，使gag/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒在真核细胞中共表达。小鼠实验表明gag/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒共表达产物能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫，表达的蛋白产物可以作为抗原进行免疫预防。本项发明为研究艾滋病病毒结构蛋白的抗原性，提供了一个获得艾滋病病毒核心蛋白的重要途径。
文档编号C12N7/01GK101504411SQ20091001055
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者林 孙, 艳 孙, 锐 张, 王洪军 申请人:沈阳药科大学