细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物小孢子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物小孢子的方法。本发明利用序列表序列1所示的细胞穿透肽将1000—10000bp的目的DNA转染经33℃高温预培养12—24小时的甘蓝型油菜或白菜的单核靠边期至双核早期游离小孢子，并在转染后再进行33℃高温预培养2天，经胚状体诱导培养和植株再生培养，可获得表达目的DNA的胚状体和基因组整合目的DNA的转基因植株，胚状体时期转化效率检测结果为6.5%—65.0%，再生植株时期PCR检测的阳性率为41.7%—49.0%。本发明为芸薹属植物小孢子转基因技术提供了一个有效的方法，对芸薹属植物相关基因功能研究和育种具有重要意义。
【专利说明】细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物小孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物小孢子的方法。
【背景技术】
[0002]细胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一类在亲水性及极性上变化很大的短肽。它们可以通过共价或非共价结合通过细胞膜，将其携带的大分子，如寡核苷酸、蛋白、药物等带入细胞，并可以通过分子设计，针对不同细胞器，实现细胞器定位转基因，是近年新发展起来的一个具有广阔应用前景的转基因载体。目前研究工作主要集中在动物细胞上，植物上的应用研究刚刚开始(Chugh et al.，2010)。细胞穿透蛋白介导的转基因技术具有高效，不需要选择标记基因，不需要基因枪或农杆菌，物种依赖性弱，CPP种类多，选择余地大，可携带的大分子种类多，可设计性强等许多突出优势，目前在国际上成为生命科学研究，特别是基因工程技术研究的新热点。它在干细胞基因工程，DNA、RNA、蛋白质、药物分子的功能研究，利用基因定点突变的反向遗传学研究，及至实现真正的分子育种上具有重要且深远的研究及应用价值。
[0003]小孢子即发育早期的花粉细胞，是植物的生殖细胞，具有单倍性、单细胞、大群体的特点。利用游离小孢子培养系统的CPP转基因可以一次性获得大量纯合的转基因株。虽然小孢子是一个理想的转基因受体材料，但由于花粉壁的特殊结构，造成壁厚、坚实，农杆菌或基因枪都难以操作的特点，小孢子的转基因国际上一直是一个难题。建立CPP在作物上的应用技术，特别是在小孢子转基因上的应用技术，不仅有利于理论研究的深入，更有益于后基因组时代对于基因功能的研究，以及利用基因工程的遗传育种。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种培育芸薹属转基因植物的方法，该方法是利用细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物(Brassica)小孢子，包括如下步骤:将细胞穿透肽与目的DNA的复合体转染处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞后，再将所述细胞经胚状体诱导培养和植株再生培养，获得导入所述目的DNA的芸薹属转基因植株。
[0005]所述单核靠边期是指小孢子细胞内的细胞质明显液泡化形成中央大液泡，细胞核位于细胞内一侧。
[0006]所述双核早期是指单核靠边期的小孢子细胞核发生一次分裂，形成了两个紧邻的细胞核。
[0007]所述胚状体是指小孢子细胞经离体培养获得的器官分化之前的胚胎。
[0008]在上述方法中，在所述转染前，还可包括将所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞在温度33°C、黑暗条件下、用所述细胞的胚状体诱导培养基静置悬浮培养12—24小时(如12、16或24小时)的步骤。
[0009]在上述方法中，在所述转染后，将所述细胞经胚状体诱导培养前，还可包括将所述细胞在温度33°C、黑暗条件下、用所述细胞的胚状体诱导培养基静置悬浮培养2天的步骤。
[0010]在上述方法中，所述细胞穿透肽为序列表序列I所示的短肽；
[0011]和/ 或，所述目的 DNA 大小为 1000— 1000bp，具体可为 1930bp、3230bp 或 7907bp。
[0012]和/或，所述复合体中的所述细胞穿透肽与所述目的DNA的质量比为4:1。
[0013]在上述方法中，所述转染按照包括如下步骤的方法进行:
[0014]将浓度为40 μ g/ml的所述细胞穿透肽溶液与浓度为10 μ g/ml的所述目的DNA溶液等体积混合后，静置15分钟，得到含有所述复合体的溶液；
[0015]将转染试剂与含有所述复合体的溶液按5 μ g:200 μ I的比例混合后静置5分钟，获得转染液；所述转染试剂具体可为Invitrogen公司的产品目录编号为Cat.N011668-019的转染试剂Lipofectamine。
[0016]将所述转染液与所述细胞的悬浮培养液混合，于温度33°C、黑暗条件下静置45分钟一I小时。
[0017]在上述方法中，所述转染前，所述细胞的所述静置悬浮培养的起始浓度为5 X 15个/mL ;将所述转染液与所述细胞的悬浮培养液混合的体积比为1:1。
[0018]在上述方法中，在所述转染后，将所述细胞经胚状体诱导培养前，所述细胞的所述静置悬浮培养的起始浓度为I X 15个/mL。
[0019]在上述方法中，所述胚状体诱导培养按照包括如下步骤的方法进行:将所述细胞于温度24°C条件下用所述细胞的胚状体诱导培养基悬浮培养至获得绿色胚状体；
[0020]所述植株再生培养按照包括如下步骤的方法进行:将所述绿色胚状体在24°C、每天16小时光照和8小时黑暗、所述光照的强度为6000LUX的条件下用B5固体培养基培养至获得具有根茎叶的所述转基因植株。
[0021]在上述方法中，当所述芸薹属植物为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)时,所述胚状体诱导培养基为NLN培养基；
[0022]当所述芸薹属植物为白菜(Brassica pekinensis)时,所述胚状体诱导培养基为添加0.lmg/L6-BA (6-苄基腺嘌呤)的NLN培养基。
[0023]在上述方法中，所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞按照包括如下步骤的方法制备:取小孢子发育至单核靠边期至双核早期的芸薹属植物花蕾，用活性氯质量百分含量为4.5%的次氯酸钠溶液浸泡6分钟后用无菌水清洗；再将所述花蕾在室温的B5液体培养基中研碎后用70 μ m孔径的滤膜过滤，收集滤液，离心，取沉淀用所述B5液体培养基清洗，获得所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞。
[0024]在上述方法中，所述B5液体培养基具体为pH为6.0，溶剂为水，溶质及其终浓度分别如下的溶液:KN033000mg/L，CaCl2.2H20750mg/L, MgSO4.7H20500mg/L, KH2PO4.H20150mg/L, (NH4) 2S04134mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B033.0mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2010.0mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H202.0mg/L, K1.75mg/L,肌醇 100mg/L，烟酸 1.0mg/L,吡哆醇 1.0mg/L 和硫胺素10.0mg/Lο
[0025]在上述方法中，所述B5固体培养基为在所述B5液体培养基中添加10g/L的琼脂。
[0026]在上述方法中，所述NLN培养基具体为pH为6.0,溶剂为水，溶质及其终浓度分别如下的溶液:KN03125mg/L, Ca(NO3)2.4H20500mg/L, MgSO4.7H20125mg/L, KH2P04125mg/L, FeSO4.7Η2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B036.2mg/L,Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2022.3mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L, ZnSO4.7H208.6mg/L,肌醇lOOmg/L,烟酸5mg/L,批唆醇0.5mg/L,硫胺素0.5mg/L,甘氨酸2.0mg/L,叶酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,谷氨酰胺800mg/L,丝氨酸lOOmg/L,谷胱甘肽30mg/L,鹿糖130g/L。
[0027]实验证明，利用序列表序列I所示的细胞穿透肽将1000— 1000bp的目的DNA转染经33°C高温预培养12 — 24小时的甘蓝型油菜或白菜的单核靠边期至双核早期游离小孢子，并在转染后再进行33°C高温预培养2天，经胚状体诱导培养和植株再生培养，可获得表达目的DNA的胚状体和基因组整合目的DNA的转基因植株，胚状体时期转化频率检测结果为6.5%—65.0%，再生植株时期PCR检测的阳性率为41.7%—49.0%。本发明为芸薹属植物小孢子转基因技术提供了一个有效的方法，对芸薹属植物相关基因功能研究和育种具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为甘蓝型油菜小孢子胚状体形成的再生转基因植株。
[0029]图2为目的DNA35S CaMV-gus-nos (3230bp)转染甘蓝型油菜小孢子后形成胚状体的⑶S染色结果。
[0030]图3为目的DNA35S CaMV-gfp-nos (1930bp)转染甘蓝型油菜小孢子后形成胚状体的GFP发光检测结果。
[0031]图4为目的DNA35S CaMV-gus_nos (3230bp)转染甘蓝型油菜小孢子形成的再生转基因植株叶片的GUS染色结果。
[0032]图5为PCR检测结果。其中，泳道M为分子量标准，从下至上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp，代表空白对照，N代表阴性对照，泳道I一9为目的DNA35SCaMV-gfp-nos (1930bp)转染甘蓝型油菜小孢子形成的不同再生转基因植株，泳道10—15为目的DNA35S CaMV-gfp-nos+ (7907bp)转染甘蓝型油菜小孢子形成的不同再生转基因植株。
[0033]图6为Southern杂交检测结果。其中，泳道M为中的条带大小为600bp,水代表空白对照，PS代表质粒PCAMBIA1302阳性对照，CK代表阴性对照，泳道I一4为目的DNA35SCaMV-gfp-nos (1930bp)转染甘蓝型油菜小孢子形成的不同再生转基因植株。
【具体实施方式】
[0034]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]下述实施例中所用的培养基如下:
[0037]B5液体培养基为文献“Gamborg et al.Plant tissue culture media.1n vitro,1976，12:473-478”中的B5液体培养基；具体为pH为6.0，溶剂为水，溶质及其终浓度分别如下的溶液:KN0330 0 0mg/L，CaCl2.2H20750mg/L, MgSO4.7H20500mg/L, KH2PO4.H20150mg/L, (NH4) 2S04134mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B033.0mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2010.0mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H202.0mg/L, K1.75mg/L,肌醇 100mg/L，烟酸 1.0mg/L,吡哆醇 1.0mg/L 和硫胺素10.0mg/Lο
[0038]B5固体培养基为在所述B5液体培养基中添加10g/L的琼脂。
[0039]NLN 培养基为文献“Nitsch JP and C.Nitsch.Haploid plants from pollengrains.Science, 1969，163:85-87”中的NLN培养基；具体为pH为6.0，溶剂为水，溶质及其终浓度分别如下的溶液:KN03125mg/L, Ca(NO3)2.4H20500mg/L, MgSO4.7H20125mg/L, KH2P04125mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L,H3BO36.2mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2022.3mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H208.6mg/L,肌醇 lOOmg/L,烟酸 5mg/L,批唆醇 0.5mg/L,硫胺素 0.5mg/L,甘氨酸
2.0mg/L,叶酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,谷氨酰胺800mg/L,丝氨酸lOOmg/L,谷胱甘肽30mg/L,鹿糖 130g/L。
[0040]下述实施例中所用的质粒pCAMBIA1301和pCAMBIA1302均购自Cambia。
[0041]实施例1、培育甘蓝型转基因油菜
[0042]一、培育甘蓝型转基因油菜
[0043]1、游离小孢子细胞的制备
[0044]人工气候室种植甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种Topas (文献:Pechan PMand Keller WA.1dentificat1n of potentially embryogenic microspores in Brassicanapus, Phys1l.Plant, 1988，74:377-384.公众可从北京市农林科学院获得)，在开花期时，油菜生长的温度为白天10°c、夜晚5°C，光周期为每天16小时光照、8小时黑暗。日常维护中及时去除种荚，病或黄萎叶片，以维持植株处于旺盛的生殖生长期。
[0045]取上述开花期植株的小孢子细胞发育至单核靠边期至双核早期的花蕾，用活性氯质量百分含量为4.5%的次氯酸钠溶液浸泡6分钟后，用无菌水清洗3次；再将所述花蕾在室温下的B5液体培养基中研碎后用70 μ m孔径的滤膜过滤,收集滤液，100rpm离心,取沉淀用所述B5液体培养基清洗3次，获得处于单核靠边期至双核早期的油菜游离小孢子细胞。
[0046]2、转染前的预培养
[0047]将步骤I制备的油菜游离小孢子细胞，用胚状体诱导培养基(即NLN培养基)调整至细胞密度为5 X 15个/mL，按每孔200 μ L分装至24孔细胞培养板中，置于温度33°C、黑暗条件下、静置悬浮培养16小时，获得所述细胞的悬浮培养液。
[0048]3、转染
[0049]1)将人工合成的序列表序列I所示的细胞穿透肽Tat2用无菌水配制成浓度为40 μ g/ml的溶液A ;将欲导入植物细胞的目的DNA (35S CaMV-gus-nos (3230bp)、35SCaMV-gfp_nos( 1930bp)或35S CaMV-gfp_nos+(7907bp))用无菌水配制成浓度为 10 μ g/ml的溶液B ;将质量浓度比为4:1的溶液A与溶液B等体积混合后，静置15分钟，使细胞穿透肽与目的DNA形成复合体，得到含有所述复合体的溶液C ；
[0050]2)将转染试剂Lipofectamine (浓度为I μ g/ μ I,购自Invitrogen,产品目录编号为Cat.N011668-019)按照5 μ g:200 μ I的比例与含有所述复合体的溶液C混合后静置5分钟，获得转染液；
[0051] 3)将所述转染液与步骤2获得的所述细胞的悬浮培养液等体积混合，于温度33°C、黑暗条件下静置I小时，获得转染细胞培养液。
[0052]所述目的DNA35S CaMV-gus-nos (3230bp)、35S CaMV-gfp-nos (1930bp)和35SCaMV-gfp-nos+ (7907bp)的制备方法如下:
[0053]取质粒pCAMBIA1301用Sph I酶切，回收长度为3230bp的DNA片段(SP35SCaMV-gus-nos)，该片段的结构为35S CaMV启动子、gus基因和nos终止子；
[0054]取质粒pCAMBIA1302用Sph I酶切，回收长度为1930bp的DNA片段(SP35SCaMV-gfp-nos)，该片段的结构为35S CaMV启动子、gfp基因和nos终止子；
[0055]取质粒pCAMBIA1301用EcoR I和Sac II双酶切，回收长度为7907bp的DNA片段(即35S CaMV-gus-nos+)，该片段的结构为35S CaMV启动子、gus基因、nos终止子和部分载体骨架片段。
[0056]4、转染后的预培养
[0057]将步骤3所述的转染细胞培养液转移至盛有2.6mL胚状体诱导培养基(即NLN培养基)的直径为6cm的培养皿中，使所述细胞的浓度为IX 15个/mL，继续于温度33°C、黑暗条件下、静置悬浮培养2天。
[0058]5、胚状体诱导培养和植株再生培养
[0059]将经步骤4培养后的所述细胞的培养液置于温度24°C、黑暗条件下静置悬浮培养3周获得鱼雷期至子叶期的胚状体；再将该培养液置于温度24°C、光周期为每天光照16小时和黑暗8小时、光照强度为6000LUX、转速为10rpm条件下振荡悬浮培养I周获得绿色胚状体；
[0060]将所述绿色胚状体转移至B5固体培养基上，于24°C、每天16小时光照、8小时黑暗、所述光照强度为6000LUX的条件下培养3— 4周，获得具有根茎叶的转基因植株(图1)。[0061 ] 二、标记基因表达检测
[0062]1、胚状体的标记基因表达检测
[0063]在上述步骤一中的步骤5中，在将经步骤4培养后的所述细胞的培养液置于温度24°C、黑暗条件下静置悬浮培养2周时，各培养皿内都有多量的胚状体形成，胚状体发育处于心形期至子叶期，此时从转染不同目的DNA的各处理中分别随机取2— 4个培养皿(每皿为一个重复)进行标记基因gus或gfp的表达检测，统计不同长度目的DNA的转化频率(=显色胚状体数/检测的胚状体数X 100%),结果如表1所示:
[0064]表1、不同长度目的DNA的转化频率统计结果
[0065]
【权利要求】
1.一种培育芸薹属转基因植物的方法，包括如下步骤: 将细胞穿透肽与目的DNA的复合体转染处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞后，再将所述细胞经胚状体诱导培养和植株再生培养，获得导入所述目的DNA的芸薹属转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在所述转染前，包括将所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞在温度33°C、黑暗条件下、用所述细胞的胚状体诱导培养基静置悬浮培养12 — 24小时的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:在所述转染后，将所述细胞经胚状体诱导培养前，包括将所述细胞在温度33°C、黑暗条件下、用所述细胞的胚状体诱导培养基静置悬浮培养2天的步骤。
4.根据权利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于:所述细胞穿透肽为序列表序列I所示的短肽； 和/或，所述目的DNA大小为100 — 1000bp。 和/或，所述复合体中的所述细胞穿透肽与所述目的DNA的质量比为4:1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述转染按照包括如下步骤的方法进行: 将浓度为40 μ g/ml的所述细胞穿透肽溶液与浓度为10 μ g/ml的所述目的DNA溶液等体积混合后，静置15分钟，得到含有所述复合体的溶液； 将转染试剂与含有所述复合体的溶液按5 μ g:200 μ I的比例混合后静置5分钟，获得转染液； 将所述转染液与所述细胞的悬浮培养液混合，于温度33°C、黑暗条件下静置45分钟一I小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 所述转染前，所述细胞的所述静置悬浮培养的起始浓度为5 X 15个/mL ； 将所述转染液与所述细胞的悬浮培养液混合的体积比为1:1。
7.根据权利要求1一6中任一所述的方法,其特征在于: 在所述转染后，将所述细胞经胚状体诱导培养前，所述细胞的所述静置悬浮培养的起始浓度为I X 15个/mL。
8.根据权利要求1一7中任一所述的方法，其特征在于:所述胚状体诱导培养按照包括如下步骤的方法进行:将所述细胞于温度24°C条件下用所述细胞的胚状体诱导培养基悬浮培养至获得绿色胚状体； 所述植株再生培养按照包括如下步骤的方法进行:将所述绿色胚状体在24°C、每天16小时光照和8小时黑暗、所述光照的强度为6000LUX的条件下用B5固体培养基培养至获得具有根茎叶的所述转基因植株。
9.根据权利要求1一8中任一所述的方法，其特征在于: 当所述芸薹属植物为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)时,所述胚状体诱导培养基为NLN培养基； 当所述芸薹属植物为白菜(Brassica pekinensis)时,所述胚状体诱导培养基为添加.0.lmg/L6-BA 的 NLN 培养基。
10.根据权利要求1一9中任一所述的方法，其特征在于:所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离小孢子细胞按照包括如下步骤的方法制备:取小孢子发育至单核靠边期至双核早期的芸薹属植物花蕾，用活性氯质量百分含量为4.5%的次氯酸钠溶液浸泡6分钟后用无菌水清洗；再将所述花蕾在室温的B5液体培养基中研碎后用70 μ m孔径的滤膜过滤，收集滤液，离心，取沉淀用所述B5液体培养基清洗，获得所述处于单核靠边期至双核早期的芸薹属植物游离 小孢子细胞。
【文档编号】A01H5/00GK104073519SQ201310101986
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2013年3月27日
【发明者】刘凡, 王桂香, 宗梅, 韩硕, 秦莹, 张月云 申请人:北京市农林科学院