水稻转录因子Os11g01130基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os11g01130基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os11g01130基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒长度、宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s11 g01130基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0sllg01130基因的应用。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003]在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004]Homeoboxes (同源结构域蛋白)HB家族转录因子在动物界首先在果蝇中，植物在拟南芥中首次被发现。HB家族有300多个成员，参与了生物的生长发育多个方面(Jack etal.，1992)。从结构上分析，Homeoboxes拥有DNA识别位点，包括TATA等一系列和DNA结合的结构域。
[0005]Homeoboxes (同源结构域蛋白)HB家族转录因子除了含有一般的DNA绑定结构域外，还拥有KN0X1,KN0X2同源结构域。homeodomains (同源异型结构域)中间由多个螺旋组成，也正是这些保守的螺旋域构成了 HB家族的功能保守域。该类转录因子主要参与细胞的生长、分化和器官的发育、分化等方面的生物过程。
[0006]目前已有报道WUSCHEL基因对顶端分生组织中确切的干细胞数量具有重要影响(Vandenbussche et al.，2009)。Jan Lohmann博士对模式植物拟南芥进行了精巧的遗传和生化实验，并因此确定出了四个在分生组织中可能连接植物激素和遗传调节因子的基因。激素本身能刺激分生组织的干细胞分裂。与此同时，它还活化不同的ARR基因，这类基因能破坏细胞分裂素信号链。WUSCHEL基因通过终止它的负反馈环路来支持细胞分裂素的功效，这解释了之前发现携带缺陷性的WUSCHEL基因的拟南芥为什么会只发育成很小的分生组织并出现生长障碍。
[0007]HB家族转录因子Os 11 gO 1130和WUSCHEL基因具有很高的同源性，可能在胚胎发育和调控种子大小形状方面有着与WUSCHEL基因同样的功能。
[0008]目前HB家族和WUS对种子大小形状调控机制的研究及认识很少，因此该转录因子的研究在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供了新的线索；在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。
[0009]VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动物病毒基因中发现，现在已被广泛的应用到植物中主要用于植物基因的转录控制的研究中，因转录因子在其体内其作用大体上可以分成两种:一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，在转基因植株中就会出现更明显的表型变化。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供水稻转录因子0sllg01130基因的应用。
[0011]一种水稻转录因子0sllg01130的基因，是下面(a)或(b)定义的多核苷酸:
[0012](a)如SEQ No:1所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0013](b)在严格条件下与SEQ No:1所不核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸。
[0014]本发明还提供了一种载体的构建方法，具体步骤如下:
[0015]Ca)在植物转录因子数据库中找到0sllg01130基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F:5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCTCAGACCCCTTCGA-3’ 和反向引物R:5’ -CAAGAAAGCTGGGTCTTAATTGGTGGAGGTGGAGCAAG-3’ ；
[0016](b)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0sllg01130全序列；
[0017](c)将PCR产物克隆到连接I3DONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列；
[0018](d)以双元表达载体PCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将 ubi promoter-VP64-Gateway 表达单兀、35Spromoter-asRED 表达单兀和 35Spromoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQ IDN0.4所示；
[0019](e)通过LR反应将0sllg01130构建到其目地基因的N端融合了 VP64标签的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得载体ub1:VP64_0slIgOl 130，载体全序列如SEQ IDN0.5所示。
[0020]本发明还提供了一种由上述方法构建得到的载体。
[0021]携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。
[0022]本发明还提供了一种转基因水稻植株的构建方法，具体地，采用农杆菌介导的方法利用PCAMBIA1301将权利要求3所述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，用潮霉素筛选转基因水稻植株。
[0023]本发明还提供了一种融合蛋白，其特征在于,利用VP64抗体用Western blot技术在蛋白质水平上鉴定得到权利要求4构建的转基因植株表达出的目的蛋白。
[0024]上述融合蛋白包括来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白和水稻转录因子0sllg01130。
[0025]本发明还提供了水稻转录因子0sllg01130基因在调控水稻籽粒性状中的应用。
[0026]具体地，将水稻转录因子OslIgOl 130基因的⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。
[0027]其中水稻转录因子0sllg01130基因的CDS序列如SEQ ID N0.1所示，4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0028]本发明还提供了上述融合蛋白在调控水稻籽粒性状中的应用。
[0029]本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻转录因子0sllg01130基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒长度和宽度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0031]图2为本发明实施例1中ubi:VP64-0sllg01130载体图谱。
[0032]图3为本发明VP64-0sllg01130合成型转录因子过表达转基因阳性株系的PCR鉴定，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，UBI:HB97为VP64_0sllg01130转基因水稻株系。
[0033]图4为本发明Western blot检测转基因VP64_0sllg01130阳性株系，其中WT为野生型水稻 ‘kitaake’，HB97-12、HB97-17 为 VP64_0sllg01130 转基因水稻株系。
[0034]图5为本发明转基因VP64_0sllg01130水稻改变籽粒性状的表型，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，HB97为VP64_0sllg01130转基因水稻株系。
[0035]图6为本发明VP64 (4X VP16)激活OslIgOl 130水稻改变籽粒长度的考种分析，其中 WT 为野生型水稻 ‘kitaake’，HB91-1、HB97-6、HB97-12、HB97-17、HB97-21 为VP64-0sllg01130转基因水稻株系。
[0036]图7为本发明VP64(4XVP16)激活0sllg01130水稻改变籽粒宽度的考种分析，其中 WT 为野生型水稻 ‘kitaake’，HB97-6、HB97-12、HB97-17 为 VP64_0sllg01130 转基因水稻株系。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0038]实施例10sllg01130基因的分离和植物表达载体构建
[0039]在植物转录因子数据库中找到0sllg01130基因，根据其序列设计PCR扩增引物，以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得OslIgOl 130全序列，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物。将PCR产物克隆到连接TOONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将OslIgOl 130构建到其目地基因的N端融合了 VP64标签的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上(图1，载体全序列如SEQ ID N0.4所示)，获得载体ubi:VP64-0sllg01130 (图 2，载体全序列如 SEQID N0.5 所示)。
[0040]实施例2转基因水稻植株的获得
[0041]取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上，选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导的方法利用pCambial301将载体ubi:VP64-0sllg01130转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，用潮霉素(lOOmg/1)筛选转基因水稻。
[0042]实施例3转基因水稻的鉴定
[0043]为了检测0sllg01130基因是否整合进入水稻基因组DNA，我们提取了野生型和转基因水稻叶子DNA，从基因两端的植物表达载体上设计一段引物进行PCR鉴定转基因植株，通过PCR结果发现，转基因水稻均扩增出目的条带(图3)，而野生型水稻中无此目的条带，初步确定0sllg01130基因已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中，PCR产物经测序结果分析是目的基因序列。
[0044]利用VP64抗体可以鉴定目的基因是否在转基因水稻中表达,用Western blot技术在蛋白质水平上鉴定，经过SDS-PAGE蛋白电泳-免疫印记之后-免疫荧光反应，Westernblot鉴定结果表明转基因植株杂交出目的蛋白，而野生型植株未杂交出目的蛋白(图4)。
[0045]实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0046]将转基因和野生型水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看出转基因种子明显的变长、变宽、籽粒周长增大，面积增大(图5)。通过考种的数据分析结果可以明显的看出转基因水稻种子长度(图6)、宽度(图7)、籽粒周长，面积与野生型相比具有显著的差异。
[0047]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种水稻转录因子0sllg01130的基因，是下面(a)或(b)定义的多核苷酸: Ca)如SEQ No:1所示核苷酸序列的多核苷酸； (b)在严格条件下与SEQ No:1所示核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸。
2.一种载体的构建方法，其特征在于，步骤如下: (a)在植物转录因子数据库中找到0sllg01130基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物 F: 5’ -CAAAAAAGCAGGCT TCATGCCTCAGACCCCTTCGA-3’ 和反向引物 R:5’-CAAGAAAGC TGGGTCTTAATTGGTGGAGGTGGAGCAAG-3’ ； (b)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0sllg01130全序列； (c)将PCR产物克隆到连接I3DONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列； Cd)以双元表达载体pCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64_Gateway 表达单兀、35Spromoter_asRED 表达单兀和 35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID N0.4所示； (e)通过LR反应将OslIgOl 130构建到其目地基因的N端融合了 VP64标签的植物表达载体 nVP64-hyg-asRED 上，获得载体 ub1:VP64_0slIgOl 130，载体全序列如 SEQ ID N0.5 所/Jn ο
3.权利要求2所述方法构建得到的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射或电穿孔的常规生物技术方法导入植物细胞中。
5.一种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法利用PCAMBIA1301将权利要求3所述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，用潮霉素筛选转基因水稻植株。
6.一种融合蛋白，其特征在于，利用VP64抗体用Western blot技术在蛋白质水平上鉴定得到权利要求4构建的转基因植株表达出的目的蛋白。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白和水稻转录因子0sllg01130。
8.权利要求1所述的水稻转录因子0sllg01130基因在调控水稻籽粒性状中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0sllg01130基因的⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。
10.权利要求6或7所述的融合蛋白在调控水稻籽粒性状中的应用。
【文档编号】A01H5/10GK104073503SQ201310100224
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月26日 优先权日:2013年3月26日
【发明者】赵涛, 李涛, 李宏宇, 刘斌, 刘军, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所