一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法
【专利摘要】本发明提供一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法。具体而言，本发明通过农杆菌介导，将外源基因导入到闭颖授粉的籼稻品种中。本发明的发明人发现，对于闭颖授粉水稻(尤其是水稻品种9m90)而言，常规的介导方法要么并不适用，要么转化效率很低。因此，本发明提出了一种新的转化方法，大大提高了转化效率。通过对所获得的植株进行PCR检测鉴定，可以证明外源基因已导入9m90中。该方法成功实现了闭颖授粉的籼稻品种的遗传转化，在加快性状改良过程同时，可避免花粉外传导致的基因漂移。
【专利说明】一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】，具体而言，本发明涉及一种将外源基因导入到闭颖授粉的籼稻品种，尤其是9m90的遗传转化方法
【背景技术】
[0002]水稻（Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上60%以上的人口以稻米为主食。近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，现代生物技术手段，特别是转基因技术在作物遗传改良方面的重要性日渐凸显。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。
[0003]但随着转基因作物的种植范围迅速扩大，转基因作物及其产品的安全性，引起了广泛关注。例如转基因品种花粉外传会带来基因漂移，可能产生“超级杂草”等风险，但目前缺乏实用有效的技术手段加以克服，比如物理隔离需要一定的空间阻止花粉传播（水稻需在IOOm以上），只适于小面积实验，在大面积生产中是不切实际的。
[0004]而闭颖授粉品种在整个授粉过程中，颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，可以有效抑制花粉外传，避免基因污染。通过闭颖受体来解决基因污染问题，是目前被认为最可行的技术手段，但目前生产还缺乏实用化的闭颖水稻品种。本实验室创制的9m90等闭颖授粉籼稻品种，不仅完全闭颖授粉，而且结实率、株高等重要农艺性状较好，可作为理想的转基因受体应用于品种快速遗传改良，减少生态风险。
[0005]但目前还没有闭颖授粉水稻品种的遗传转化方法的报道。为充分利用具有闭颖授粉性状的独特遗传资源，本发明旨在建立一种适用于闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种将外源基因导入到闭颖授粉的籼稻品种9m90的遗传转化方法、利用该方法生产转基因水稻的方法。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。
[0007]在一个方面，本发明提供一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
[0008]步骤I、提取水稻种子的胚，将所述胚置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
[0009]步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；
[0010]步骤3、对所获得的愈伤组织进行农杆菌侵染；
[0011]步骤4、对所述愈伤组织进行前筛选；
[0012]步骤5、将经前筛选的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织
[0013]步骤6、对所述抗性愈伤组织进行分化再生，以分化成苗；[0014]步骤7、将所获得的苗转移到生根培养基中生根。
[0015]优选地，所述水稻种子为闭颖授粉籼稻品种9m90的种子。[0016]优选地，所述步骤I包括将所述水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，所述愈伤组织诱导培养基中[NO3-]/[NH4+] =20禮/201111，并且含有3(^1氯化钴。
[0017]优选地，所述步骤3包括：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触15分钟，然后将所获得的愈伤组织转移到上垫有无菌滤纸的培养皿中在21-23°C培养48小时；
[0018]所述步骤4包括将愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
[0019]所述步骤6包括将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗。 [0020]优选地,所述无菌滤纸中加入2. 5-3. 5mL农杆菌悬浮培养基,所述农杆菌悬浮培养基中[NO3I/[NH4+] = 20mM/20mM ；
[0021]所述愈伤组织转移筛选培养基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化钴；
[0022]所述分化再生培养基中[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化钴、lmg/L激动素（KT)和lmg/L萘乙酸（NAA);并且
[0023]所述生根培养基中含O. 4mg/L的NAA。
[0024]优选地，所述步骤I中的种子是成熟种子；和/或
[0025]所述诱导培养基包括预定配比的N6大量元素（[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化钴、8g/L琼脂；和/或
[0026]所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；和/或
[0027]所述农杆菌悬浮培养基包括预定配比的N6大量元素（[N<V] / [NH4+]=20mM/20mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4-D、20g/L麦芽糖、10g/L葡萄糖、100 μ mo I/L乙酰丁香酮；和/或
[0028]所述前筛选培养基包括预定配比的N6大量元素（[NO3M/[NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化钴、8g/L琼脂、250mg/L羧苄青霉素；和/或
[0029]所述筛选培养基包括预定配比的N6大量元素（[NO3M / [NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化钴、8g/L琼脂、50mg/L潮霉素、250mg/L羧苄青霉素；和/或
[0030]所述分化再生培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、lg/L CH、30g/L 鹿糖、30g/L sorb i to I > 500mg/L MES >2. 5mg/L CuS04、lmg/L KT、lmg/L 萘乙酸（NAA)、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、30 μ M氯化钴、8g/L琼脂；和/或
[0031]所述生根培养基包括1/2MS基础盐（2. 165g/L)、MS维生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、O. 4mg/L NAA、125mg/L羧苄青霉素、3. 5g/L植物凝胶。
[0032]这里预定配比的N6大量元素指的是培养基中[N(V]/[NH4+] = 20mM/20mM。
[0033]另一方面，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括：
[0034]I)通过上述方法将外源基因导入水稻细胞；和
[0035]2)利用所获得的水稻细胞培育水稻植株。
[0036]在一种实现方式中，所述方法包括下述具体步骤：[0037](I)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
[0038](2)次级愈伤组织转移至新的诱导培养基预培养；
[0039](3)将步骤⑵中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触15分钟；
[0040](4)将步骤（3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸（加入2. 5-3. 5mL农杆菌悬浮培养基）的培养皿中，21-23°C培养48小时；
[0041](5)将步骤（4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
[0042](6)将步骤（5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
[0043](7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
[0044](8)将步骤（7)的苗转移到生根培养基中生根。
[0045]在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分： [0046](I)愈伤组织诱导培养基；
[0047](2)农杆菌悬浮培养基；
[0048](3)前筛选培养基；
[0049](4)筛选培养基；
[0050](5)分化再生培养基；
[0051](6)生根培养基。
[0052]其中所述（1)-(6)分别包含如说明书表1所示的成分。
[0053]本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选籼稻，包括但不限于9m90等闭颖授粉籼稻品种。
[0054]技术效果
[0055]本发明的方法成功实现了闭颖授粉的籼稻品种的遗传转化，从而在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，降低可能的生态风险。
[0056]通过本发明，可以实现对水稻尤其是闭颖授粉籼稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化（对于水稻品种9m90而言，常规的介导方法要么并不适用，要么转化效率很低）；另一方面，本发明步骤简单（如不需洗菌和预分化，只需一轮筛选），缩短周期，节约成本，适合高通量操作，便于规模化应用。从而为开发工业规模的、无基因漂移的转基因水稻制备工艺提供了可能。
[0057]表1培养基的示例性配方
[0058]
【权利要求】
1.一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤: 步骤1、提取水稻种子的胚，将所述胚置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织； 步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养； 步骤3、对所获得的愈伤组织与携带所述外源基因的农杆菌接触，进行农杆菌侵染； 步骤4、对所述愈伤组织进行前筛选； 步骤5、将经前筛选的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织； 步骤6、对所述抗性愈伤组织进行分化再生，以分化成苗； 步骤7、将所获得的苗转移到生根培养基中生根。
2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述水稻种子为闭颖授粉籼稻品种9m90的种子。
3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于， 所述步骤I包括将所述水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，所述愈伤组织诱导培养基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM,并且含有 30 μ M 氯化钴。
4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于， 所述步骤3包括:将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触15分钟，然后将所获得的愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的培养皿中在21-23°C培养48小时； 所述步骤4包括将愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天； 所述步骤6包括将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗。
5.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，所述农杆菌悬浮培养基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM ； 所述愈伤组织转移筛选培养基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM，并且含有30 μ M氯化钴；所述分化再生培养基中[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化钴、lmg/L激动素(KT)和lmg/L萘乙酸(NAA);并且所述生根培养基中含0.4mg/L的NAA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于， 所述步骤I中的种子是成熟种子；和/或 所述诱导培养基包括N6大量兀素、B5微量兀素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸、.30 μ M氯化钴、8g/L琼脂；和/或 所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；和/或所述农杆菌悬浮培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4_D、20g/L麦芽糖、1g/L葡萄糖、.100 μ mo I/L乙酰丁香酮；和/或 所述前筛选培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、.500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2，4-D、.30 μ M氯化钴、8g/L琼脂、250mg/L羧苄青霉素；和/或 所述筛选培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2, 4_D、30 μ M氯化钴、8g/L琼脂、50mg/L潮霉素、250mg/L羧苄青霉素；和/或 所述生根培养基包括1/2MS基础盐2.165g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、.0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括农杆菌菌株的培养和悬浮液准备，所述农杆菌菌株的培养包括进行两次活化。
8.一种生产转基因水稻的方法，包括: 1)通过权利要求1-7中任意一项所述的方法将外源基因导入水稻细胞；和 2)利用所获得的水稻细胞培育水稻植株。
9.一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分: (1)愈伤组织诱导培养基； (2)农杆菌悬浮培养基； (3)前筛选培养基； (4)筛选培养基； (5)分化再生培养基； (6)生根培养基，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基、所述农杆菌悬浮培养基和所述分化再生培养基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM。
【文档编号】A01H5/00GK104031938SQ201410235771
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】倪大虎, 杨剑波, 魏鹏程, 李 浩, 杨亚春, 李莉, 倪金龙, 陆徐忠, 宋丰顺, 马卉, 秦瑞英 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所