专利名称：：Ptp1b基因突变的检测以及其在癌症诊断中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌症的诊断和检测领域，具体涉及PTP1B基因突变的检测方法，检测癌症的试剂盒以及其在癌症诊断方面的应用。
背景技术：
：蛋白质酪氨酸磷酸化是一种重要的细胞信号调节机制，影响着细胞生长和分化、细胞周期调节、凋亡及迁移等重要生理过程。细胞内的酪氨酸磷酸化状态是随细胞功能不断变化的可逆的动态平衡，由蛋白质酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinase,PTK)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(ProteinTyrosinePhosphotase，PTP)协同维持。PTK、PTP及各自相应底物共同组成一个影响广泛的信号转导网络。一旦由于种种原因使上述两大酶家族中的关键成员的基因突变，基因敲除或蛋白质转录后修饰发生异常等都能引起正常细胞转化即癌变。PTP1B是PTP基因家族中的一员。人类PTP1B为单拷贝基因，由PTPN1基因编码，定位于20ql3.1-q13.2，基因全长约74kb，共10个外显子，其cDNA全长3318bp，编码435个氨基酸的蛋白质，分子量约为49，666Da。PTP1B在体内广泛表达，其底物蛋白包括胰岛素受体(IR)、表皮生长因子受体(EGFR)，血小板衍生生长因子(PDGFR)，胰岛素生长因子I受体(IGF—IR)以及p210Bcr_Abl，JanusKinase2(JAK2)禾QTYK2等多种受体型PTK(RTK)。目前已知很多PTK的活性异常与肿瘤的发生直接有关联，至少有近20种PTK已经被鉴定为癌基因。近年来的研究证实，PTP1B可以通过特异性地去除PTK酪氨酸残基上的磷酸基团，改变其磷酸化状态，从而负调控多种PTK信号传导通路，影响细胞重要生理功能。PTP1B基因的核苷酸序列见PTP1B文件所述(共3318bp)，其中包含10个外显子，分别是Exonl:l-237bp;Exon2:238-328bp;Exon3:329-429bp;Exon4:430-528bp;Exon5:529-666bp;Exon6:667-876bp;Exon7:877-1038bp;Exon8:1039國1262bp;Exon9:1263-1458bp;Exon10:1459画3318bp,示意如Exon1—Exon之Exon3Exon4_Exon5—Exon6一Exon7Exon8Exon9Exon10我们首次在中国恶性肿瘤人群中发现PTP1B基因的丢失，即外显子不同程度的缺失引起PTP1B基因核苷酸序列的改变。这些PTP1B突变基因的发现将有助于恶性肿瘤在早期及不同病理期的精确诊断。
发明内容本发明的目的之一在于提供一类与癌症发生有关的PTP1B突变基因，其特征在于，PTP1B基因中存在突变位点，其突变位置分别是PTP1B基因238-328bp、PTP1B基因309-328bp、PTP1B基因529-666bp、PTP1B基因667-876bp、PTP1B基因778-783bp、PTP1B基因730-953bp、PTP1B基因1037-1042bp、PTP1B基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQID:Nol、SEQID:No2、SEQID:No3、SEQID:No4、SEQID:No5、SEQID:No6、SEQID:No7、SEQID:No8所示。本发明的另一目的在于提供一种癌症的检测方法，该方法是检测来自于待测个体的样本中的PTPIB基因是否存在突变位点，其突变位置分别是PTPIB基因238-328bp、PTPIB基因309-328bp、PTPIB基因529-666bp、PTPIB基因667-876bp、PTPIB基因778-783bp、PTPIB基因730-953bp、PTPIB基因1037-1042bp、PTPIB基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQID:Nol、SEQID:No2、SEQID:No3、SEQID:No4、SEQID:No5、SEQID:No6、SEQID:No7、SEQID:No8所示。其中，所述的检测方法，包括下述步骤1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;2)以所述DNA为模板，以针对突变位置附近编码区设计的PCR引物进行PCR反应得到PCR反应产物；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序分析，将所得的序列与PTPIB正常基因的标准序列进行比较，确定是否存在上述突变位点。54)根据以上结果判断待测个体是否具有癌症相关的PTP1B基因突变。在上述的检测方法中使用的PCR引物可以依据已知的PTP1B基因序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45.50%左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用引物设计软件设计了一组PCR引物，其序列为1)配对引物上游5，-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC-3，检测突变位点引物序列扩增片段长度缺失序列667-876下游5'墨TCCTCTTGTCCATTGTAA墨3'500bp缺失序列529-666下游5'-TCTTGGGTCGAACCT-3，362bp缺失序列730-953下游5'-TCTGGATCAGGGACT-3'563bp缺失序列778-783下游5，-GGCTGAGTGACTCTC-3'610bp2)配对引物下游5'-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAACCTGTAG-3，检测突变位点引物序列扩增片段长度缺失序列1281-1384上游5'-AAGACACTGAGTTAC國3，108bp缺失序列1037-1042上游5'-TTCCGTGCAGTGGAA-3'448bp3)检测突变位点引物序列扩增片段长度缺失序列238-328上游5，-CATTTACCAGTTGACCAT-3'下游5，-AGCTGTCGCACTGTATAA-3，329bp缺失序列309-328上游5'-CCGAAATAGGTTGACCAT-3，下游5，-AGCTGTCGCACTGTATAA國3'329bp本发明的再一目的是提供用于检测PTP1B基因突变的试剂盒，所述的试剂盒中可以包括以下几种试剂的一种或几种的组合1)从待测样本中提取DNA的试剂；2)用于扩增样本DNA中PTP1B基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂；6以及3)对PCR扩增产物进行测序的试剂。例如，本发明的个实施方案中提供一个检测PTP1B基因突变的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测PTP1B基因突变的一种或多种成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品屮PTP1B基因突变位点的试剂盒。可含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员己知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物上文中所述及的可以采用的一对引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。其使用方法请参见具体实施方式中的实施例所述。根据本发明的再一方面，提供PTP1B突变基因在诊断癌症疾病中的应用，通过检测待测个体中是否存在PTP1B基因特定的突变位点，而判断该个体癌症发生原因及类型。本发明首次提供了在中国人群中存在的PTP1B基因新的突变位点，并证明了该类突变基因与癌症的发生特异相关，这对于癌症患者的诊断有重要的意义。本发明同时提出了通过检测患者中是否存在PTP1B基因的突变而诊断癌症发生的原因和类型的检测方法。这将有利于在临床上开展癌症患者的PTP1B基因突变筛査工作，为癌症患者诊断和治疗提供服务。图1A、图1B是不同种类肿瘤标本RT-PCR结果图2是免疫印染法检测野生型和突变型的PTP1B融合蛋白的结果图3是PTP1B基因部分突变位点所做的RT-PCR结果图。具体实施例方式现依据附图并结合实施例，对本发明做进一步的描述。选取PTP1B基因作为研究对象，通过在105名各种癌症患者的样本进行筛査，发现一类与癌症有关的PTP1B基因新的突变位点。这些突变位点在国内外均未报道。发生突变的具体结果总结于下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例1PTP1B基因各外显子的PCR扩增(1).提取RNA取手术切除的病人肿瘤组织，剪碎用lmlTRIzolreagent(Invitrogen)提取RNA，加入0.2ml氯仿后剧烈振荡15秒，室温放置5分钟，4'C条件下以12000rpm离心15分钟，吸取上清液，加入0.5ml异丙醇，混匀后静置10分钟，以12000rpm离心10分钟，弃上清液，沉淀经75。/。乙醇洗涤后，用20ulDEPC-H20溶解。取2ul经稀释后在紫外分光光度计测定吸光值，按公式RNA(ug/ml)=O.D26。nmx40x稀释倍数十比色皿厚度(cm)计算得出RNA浓度。(2).RT-PCR用Invitrogen逆转录试剂盒，取上述RNAlug，加随机引物lul及dNTPlul，用DEPC-H2O补足10ul，置65。C水浴5分钟，立即放入冰浴。加入cDNA合成混合液10ul，25"放置10分钟，然后50。C放置50分钟，再85。C放置5分钟后立即放置冰浴，加入lulRNaseH后37。C水浴放置20分钟，将该cDNA在-20。C保存。样本DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增PTP1B基因，扩增片段为PTP1B基因中175-1482阅读框，长1308bp，包扩9个完整的外显子。设计扩增PTP1B基因的上游弓I物序列5，-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC-3，，下游引物序列5'-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAACCTGTAG-3'。扩增体系是10x缓冲液5ul，dNTP2ul，10umol/L上游引物和下游引物各0.5ul，MgCl22ul，样品cDNA3ul，用双蒸水补足体积48ul。经95。C灭活5分钟后，加入1U(临用前稀释至1U/2ul)具有高保真性的PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen)。扩增条件为95°C40秒,55'C40秒,68'C120秒，共25个循环。实施例2PCR产物纯化测序(1).PCR产物的连接与转化首先将上述PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，鉴定扩增片段大小是否和预期的1212bp相符，然后将鉴定正确的PCR产物连接到长3.9kb的pCR2.1-TOPO载体，并转化到大肠杆菌细胞中(TOPOTACloningKits,Invitrogen产品)。具体步骤为取PCR产物4ul，加盐溶液和TOPO载体各lul，轻轻混匀后室温静置5分钟，再3(TC放置10分钟等待连接。接着取出2ul加到OneShotRE.coli大肠杆菌液中，轻轻混匀放置冰上10分钟等待转化，然后放置42-C水浴30秒进行热休克，立即放置冰浴。在室温加入S.O.C.培养液250ul，盖紧后在37X:恒温摇床摇动1小时复苏。(2).筛选、鉴定与测序吸取100ul转化好的菌液，滴加在含氨苄青霉素100ug/ml的1.5%LB琼脂平板上，再加40ulX-gal，立即用玻璃棒均匀涂布，然后将平板放置37。C恒温培养箱孵育16-18小时，观察平板上细菌生长状况(有兰色菌落和白色菌落)。挑取单个白色菌落到3mlLB液体培养基中，37'C恒温摇床摇动培养过夜，待小量扩增。次日吸取lml菌液到EP管，抽提细菌质粒DNA用Geneaid的快速小量质粒提取盒。先将菌液12000rpm离心1分钟后弃上清液，在沉淀中加入200ul含RNaseA的溶液I，重悬细菌，加入200ul溶液II轻轻颠倒混匀放置5分钟裂解细菌，再加300ul溶液III轻轻颠倒混匀，全速离心3分钟，吸取上清液到离心柱，将离心柱13000rpm离心30秒以结合DNA，然后在离心柱加入含乙醇的洗涤缓冲液再次13000rpm离心30秒，弃净缓冲液，在离心柱内加入50ull0mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.5)溶解DNA,静置2分钟后全速离心2分钟，收集流出液即为细菌质粒DNA。取DNA5ul，加2ull0x缓冲液及10U限制性内切酶EcoRI，用双蒸水补足20ul体积，置37"C水浴酶切2小时，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，鉴定质粒上确实有外接片段，大小约为1.3kb(图1)，送英骏公司进行DNA测序。不同种类肿瘤标本RT-PCR结果请见图1A及图1B所示。在图1A中由左起依次是l.lkbDNALadder;2.正常甲状腺组织；3.甲状腺癌62;4.甲状腺癌186;5.甲状腺癌234;6.甲状腺癌330;7.正常胃组织227;8.胃癌4。在图1B中，由左起依次是l.lkbDNALadder;2.正常结肠组织；3.肠癌8、4.肠癌36、5.肠癌10、6.肠癌13、7.肠癌93、8.肠癌69;9.肠癌45。RT-PCR结果分析如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3基因转染，蛋白质表达和免疫印染取3ugpTetsplice-PTPlBWT-HA和3ugpTetsplice-PTPlBAE6-HA分别和3ugpTet-tTAK，0.3ugpSV2neo—起共转染REF(ratembryofibroblast)细胞，转染48小时后G4180.5mg/ml筛选两周，挑取稳定转染细胞克隆。稳转细胞分别经强力霉素(Dox)诱导16小时后，收集并制成全细胞悬液，分别从每个全细胞悬液中取30ug蛋白进行PAGE电泳，然后转移至NC膜上，用5。/。脱脂奶粉TBS封闭2小时，加抗HA抗体(1:200稀释)置4"C反应12-14小时，TBS(含0.1%Tween-20)室温洗涤NC膜3次，每次10分钟，接着加二抗(l:10000稀释)，最后显影，结果请见图2所示。在图中，用免疫印染法(westernblot)检测野生型(wild-type)和突变型(mutants)的PTP1B融合蛋白(抗HA抗体)，其中1.未转染REF细胞；2.pTetsplice-PTPlBAE6-HA转染REF细胞，添加强力霉素(Dox);3.pTetsplice-PTPlBAE6-HA转染REF细胞，不添加强力霉素16小时；4.pTetsplice-PTPlBWT-HA转染REF细胞，添加强力霉素；5.pTetsplice-PTPlBWT-HA转染REF细胞，不添加强力霉素16小时。实施例4PCR反应引物设计根据在实验中所发现的多个PTP1B突变位点，发明人设计了一系列下游引物分别和用于扩增PTP1B基因的上、下游引物序列配对，用于检测临床病理组织样本，经突变基因特异PCR扩增可得到相应的突变基因扩增产物，从而证实该样本在相应的位点有突变。此突变基因特异PCR方法不能扩增肿瘤旁组织即正常组织的PTP1B，请见下表。1)配对引物上游5，-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC-3，检测突变位点引物序列扩增片段长度缺失序列667-876下游5'-TCCTCTTGTCCATTGTAA-3'500bp缺失序列529-666下游5，-TCTTGGGTCGAACCT-3，362bp缺失序列730-953下游5，隱TCTGGATCAGGGACT-3'563bp缺失序列778-783下游5，-GGCTGAGTGACTCTC-3'610bp2)配对引物下游5，-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAACCTGTAG-3，检测突变位点引物序列扩增片段长度缺失序列1281-1384上游5，-AAGACACTGAGTTAC-3，108bp缺失序列1037-1042上游5,-TTCCGTGCAGTGGAA-3"448bp3)检测突变位点引物序列扩增片段长度11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>对于部分突变位点所做的RT-PCR结果如图3所示，在图中自左起分别是l.lkbDNALadder;2.肿瘤旁组织；3.缺失序列667-876(500bp);4.肿瘤旁组织;5.缺失序列529-666(362bp);6.肿瘤旁组织;7.缺失序列730-953(563bp);8.肿瘤旁组织；9.缺失序列778-783(610bp);10.肿瘤旁组织；11.缺失序列腦-1384(108bp);12.月中瘤旁组织;13.缺失序列1037-1042(448bp)上述实施例中对各种不同类型的肿瘤组织进行PTP1B基因分析，实验中所发现的多个PTP1B突变基因迄今为止未见国内外有相同报导。本发明提供了中国人群中PTP1B突变基因特异性检测方法和临床应用，应用上述检测方法将可以判断及跟踪恶性肿瘤的早期发生，发展及转移过程中的重要分子指标，从分子水平对恶性肿瘤的早期诊断和观察抗肿瘤药物治疗后的有效预测有指导意义。序列表SEQUENCELISTING<110>上海交通大学医学院<120>PTPIB基因突变的检测以及其在癌症诊断中的应用<130>/<160>8<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>91<212>DNA<213>Homosapiens<400>1gatatccgacatgaagccagtgacttcccatgtagagtggccaagcttcctaagaacaaa60aaccgaaataggtacagagacgtcagtccct91<210>2<211>20<212>DNA<213>Homosapiens<400>2gtacagagacgtcagtccct20<210>3<211>138<212>DNA<213>Homosapiens<400>313ttaaaatgcgcacaatactggccacaaaaagaagaaaaagagatgatctttgaagacaca60aatttgaaattaacattgatctctgaagatatcaagtcatattatacagtgcgacagcta120gaattggaaaaccttaca138<210>4<211>210<212>DNA<213>Homosapiens<400>4acccaagaaactcgagagatcttacatttccactataccacatggcctgactttggagtc60cctgaatcaccagcctcattcttgaactttcttttcaaagtccgagagtcagggtcactc120agcccggagcacgggcccgttgtggtgcactgcagtgcaggcatcggcaggtctggaacc180ttctgtctggctgatacctgcctcttgctg210<210>5<211>6'<212>DNA<213>Homosapiens<400>5gggtcaG<210>6<211>224<212>DNA<213〉Homosapiens<400>6gaatcaccagcctcattcttgaactttcttttcaaagtccgagagtcagggtcactcagc60ccggagcacgggcccgttgtggtgcactgcagtgcaggcatcggcaggtctggaaccttc120tgtctggctgatacctgcctcttgctgatggacaagaggaaagacccttcttccgttgat180atcaagaaagtgctgttagaaatgaggaagtttcggatggggct224<210>7<211>6<212>DNA<213>Homosapiens<400>aggatc<210>8<211>104<212>DNA<213>Homosapiens<400>8agttagaagtcgggtcgtggggggaagtcttcgaggtgcccaggctgcctccccagccaa60aggggagccgtcactgcccgagaaggacgaggaccatgcactga1041权利要求1、一类与癌症发生有关的PTP1B突变基因，其特征在于，PTP1B基因中存在突变位点，其突变位置分别是PTP1B基因238-328bp、PTP1B基因309-328bp、PTP1B基因529-666bp、PTP1B基因667-876bp、PTP1B基因778-783bp、PTP1B基因730-953bp、PTP1B基因1037-1042bp、PTP1B基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQIDNo1、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8所示。2、一种癌症的检测方法，该方法是检测来自于待测个体的样本中的PTPIB基因是否存在突变位点，其突变位置分别是PTPIB基因238-328bp、PTPIB基因309-328bp、PTPIB基因529-666bp、PTPIB基因667-876bp、PTPIB基因778-783bp、PTPIB基因730-953bp、PTPIB基因1037-1042bp、PTPIB基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQID:Nol、SEQID:No2、SEQID:No3、SEQID:No4、SEQID:No5、SEQID:No6、SEQID:No7、SEQID:No8所示。3、如权利要求2所述的检测方法，包括下述步骤1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;2)以所述DNA为模板，以针对突变位置附近编码区设计的PCR引物进行PCR反应得到PCR反应产物；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序分析，将所得的序列与PTPIB正常基因的标准序列进行比较，确定是否存在上述突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否具有癌症相关的PTPIB基因突变。'4、如权利要求3所述的检测方法，其特征在于设计的一组PCR引物其序列为1)配对引物上游5，-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC隱3，<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>2)配对引物下游5'-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAACCTGTAG-3，<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>5、一种检测PTP1B基因突变的试剂盒，所述的试剂盒中可以包括以下几种试剂的一种或几种的组合1)从待测样本中提取DNA的试剂；2)用于扩增样本DNA中PTP1B突变基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂；以及3)对PCR扩增产物进行测序的试剂。6、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的PTP1B突变基因其突变位置分别是PTP1B基因238-328bp、PTP1B基因309-328bp、PTP1B基因529-666bp、PTP1B基因667-876bp、PTP1B基因778-783bp、PTP1B基因730-953bp、PTP1B基因1037-1042bp、PTP1B基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQID:Nol、SEQID:No2、SEQID:No3、SEQID:No4、SEQID:No5、SEQID:No6、SEQID:No7、SEQID:No8所示。7、PTPIB突变基因在诊断癌症疾病中的应用，通过检测待测个体中是否存在PTPIB基因特定的突变位点，而判断该个体癌症发生原因及类型。8、如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的突变位点的位置分别是PTPIB基因238-328bp、PTPIB基因309國328bp、PTPIB基因529-666bp、PTPIB基因667-876bp、PTPIB基因778-783bp、PTPIB基因730-953bp、PTPIB基因1037-1042bp、PTPIB基因1281-1384bp，上述突变位置所缺失的序列分别如序列表SEQID:Nol、SEQID:No2、SEQID:No3、SEQID:No4、SEQID:No5、SEQID:No6、SEQID:No7、SEQID:No8所示。全文摘要本发明首次提供了在中国人群中存在的PTP1B基因新的突变位点，并证明了该类突变基因与癌症的发生特异相关，这对于癌症患者的诊断有重要的意义。本发明同时提出了通过检测患者中是否存在PTP1B基因的突变而诊断癌症发生的原因和类型的检测方法。这将有利于在临床上开展癌症患者的PTP1B基因突变筛查工作，为癌症患者诊断和治疗提供服务。文档编号C12N15/55GK101487013SQ20091004618公开日2009年7月22日申请日期2009年2月13日优先权日2009年2月13日发明者梅文瀚,郑新民申请人:上海交通大学医学院