专利名称：鳞翅目害虫的高毒力核型多角体病毒构建技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用双链RNA干涉等现代分子生物学手段，改造野生核型多角体病毒(NPV)，构建鳞翅目害虫的高毒力NPV的技术。
背景技术：
鳞翅目昆虫，如尺蠖、毛虫等，是为害农作物的重要害虫种类之一。这些害虫大量发生时，造成作物严重减产和品质劣化。因此，尺蠖等鳞翅目昆虫是农作物生产上的重要防治对象之一。目前生产上应用的农药主要有两类一类是化学合成农药，如菊酯类农药、有机磷农药和杀虫脲等；另一类是生物农药，如核型多角体病毒(NPV)制剂、苏云金杆菌(Bt)制剂以及一些捕食性昆虫等。化学合成农药，防治速度快、效果好，但容易引起农产品的农药残留、环境污染以及害虫的抗药性问题。生物农药NPV属于昆虫杆状病毒，其外被为多角体蛋白，其内为双链环状DNA分子。游离NPV病毒粒子可通过昆虫进食和体壁创伤感染；而具有包含体的NPV病毒只能由昆虫进食感染，进入害虫中肠的NPV粒子在消化液的作用下，多角体蛋白被破坏并释放出游离病毒粒子，之后通过附着、融合、去壳等过程进入害虫细胞，并在核中大量复制并利用宿主细胞核糖体合成多角体包装成完整的NPV。受NPV侵染的害虫逐渐出现拒食等症状，最终死亡。但是，野生型的NPV病毒株侵染率低，潜伏期长，杀虫速度慢，防治效果不理想。因此，NPV生物农药在实际生产中推广应用还比较有限。
几丁质是尺蠖等鳞翅目害虫的卵膜、蛹壳、幼虫表皮和中肠围食膜以及成虫体壁等组织的重要组分。而几丁质是由尿嘧啶二磷酸-N-乙酰-葡糖胺通过β-1，4方式连接形成的聚合物，该反应由几丁质合成酶(CS)催化完成。CS为大分子量的细胞膜结合蛋白，主要由位于细胞膜内侧的催化活性中心和多个亲脂跨膜区域组成。
双链RNA介导的基因干涉(dsRNAi)是近年来分子生物学最突出的科研成果之一。它是一段由21-25nt组成的RNA分子，通过对靶RNA进行特异性降解而“敲除”目的基因，导致基因转录后沉默。dsRNAi技术比反义基因技术更加高效、更加特异，因此已广泛应用于生物基因表达调控研究。
发明内容
本发明在克隆尺蠖等鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)基因保守序列的基础上，根据dsRNAi可有效“敲除”目标基因的原理，构建包含鳞翅目害虫CS基因dsRNAi序列的载体，并通过酶切和连接反应将该序列成功导入野生型NPV基因组，利用NPV原有的侵染和表达系统，使CS dsRNAi序列在尺蠖等鳞翅目害虫细胞中表达，抑制害虫细胞内源的CS基因活性，破坏几丁质合成，缺乏几丁质合成的茶尺蠖将无法形成正常的细胞壁，不能进行有效的细胞分裂和生长，而且害虫重要的消化器官“中肠围食膜”因为缺乏几丁质而丧失正常消化功能，最终导致害虫死亡。改造后的新型NPV具有更快的扩散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
本发明鳞翅目害虫高毒力核型多角体病毒的构建技术包括以下步骤1、鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)基因保守序列经克隆纯化后连接到pUcm-T载体并转化大肠杆菌，经抗性筛选获包含CS保守序列的pUCm-T载体(pUCm-T-CS)；2、通过酶切和连接将CS插入双链干涉序列(dsRNAi)中间载体，获包含CS双链干涉序列的载体pFGC5941-CS-intron-CSr，经验证后转化大肠杆菌扩增；3、将pFGC5941-CS-intron-CSr中间载体双酶切后获得的CS-intron-CSr序列插入包含多角体基因(ph)的pFASTBacI-ph质粒，构建pFASTBacI-ph-CS-intronCSr；4、将pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr转化包含NPV DNA(Bacmid)和帮助质粒的大肠杆菌(DH10Bac)，获包含CS双链干涉序列的重组NPV；5、将上述重组NPV侵染草地叶蛾细胞株sf9扩增，经筛选获高毒力重组NPV。
按本技术方案所获高毒力重组NPV应用于植物鳞翅目害虫的防治。
上述步骤进一步叙述如下①.尺蠖等鳞翅目害虫CS保守序列克隆根据鳞翅目害虫CS基因保守序列设计2-4对特异引物，提取害虫mRNA，并进行RT-PCR，获得CS基因保守序列，并进行序列分析验证。CS基因RT-PCR产物纯化后连到pUCm-T载体并转化大肠杆菌，经过抗性筛选和PCR验证，获得包含CS保守序列的pUCm-T载体(pUCm-T-CS)。
②.鳞翅目害虫CS基因dsRNAi中间载体构建重新合成两对包含酶切位点的引物[其中1对包含Asc I(BssH I)/Swa I位点；另1对包含Xba I/BamH I]，以pUCm-T-CS为摸板，进行PCR扩增，获得包含酶切位点的产物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同样酶切的pFGC5941中，构建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同样酶切的pFGC5941-CS中，获包含CS双链干涉序列的载体pFGC5941-CS-intron-CSr。将获得的CS基因dsRNAi载体转化大肠杆菌、PCR验证和扩增。
③.包含CS双链干涉序列的NPV转移载体构建将提取的pFGC5941-CS-intron-CSr，以Asc I/Xba I双酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(与Asc I是同尾酶)/Xba I酶切的包含多角体基因(ph)的pFASTBac I-ph质粒，构建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
④.包含CS双链干涉序列的重组NPVpFASTBac I-ph-CS-intron-CSr转化DH10Bac(包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌)，获得包含CS双链干涉序列的重组NPV。并将重组NPV侵染草地叶蛾细胞株sf9，获完整重组NPV。
⑤.新型重组NPV病毒分子生物学验证和杀虫能力评价通过PCR等方法对重组NPV进行验证；以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV。
图1为本发明技术方案流程框图。
具体实施例方式
实施例含茶尺蠖几丁质合成酶(CS)双链干涉基因序列的NPV构建方法1)取3龄茶尺蠖幼虫1条约100mg，以Trizol(Invitrogen公司)试剂提取总RNA，电泳检测RNA质量，并以GENQUENT分析RNA浓度。具体操作参照试剂和仪器说明。
2)以MMLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工)合成茶尺蠖幼虫cDNA第一链，具体操作参照试剂盒说明。
3)以特异引物对L-CS0/R-CS0(委托上海生工合成)进行RT-PCR。PCR条件如表1。
L-CS0 5’TTCGAATACGCCATCGGCCATTGGR-CS0 5’CCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG
表1
4)上述PCR后获192bp左右CS目标产物，经纯化后与pUCm-T于16℃条件下连接过夜，连接产物pUCm-T-CS转化感受态DH5α(上海生工)，经蓝白斑筛选，以菌落PCR方法进行连接结果验证，同时进行序列分析(序列分析委托上海联合基因公司进行)，所获得的CS基因序列为TTCGAATACG CCATCGGCCATTGGCTGCAA AAGGCCACGG AGCACATGATTGGCTGCGTG CTCTGTTCACCTGGATGCTT CTCCCTGTTC AGGGGCAAGGCCCTCATGGA TGACAATGTGATGAAGAAAT ACACGACACG GTCGGATGAGGCTCGTCACT ACGTGCAGTACGATCAGGGC GAGGATCGTT GG5)阳性菌落经扩繁后，抽提质粒。
6)重新合成以下两对包含酶切位点的引物L-CS01/L-CS01和L-CS02/R-CS02(上海生工)，以包含CS序列的T载体(pUCm-T-CS)为模板，进行PCR扩增，获得包含酶切位点的产物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同样酶切的pFGC5941，构建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同样酶切的pFGC5941-CS，获包含CS双链干涉序列的载体pFGC5941-CS-intron-CSr。将包含CS基因dsRNAi载体转化大肠杆菌、PCR验证和扩增。
L-CS01 5’AAGGCGCGCCTTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Asc I(BssH I)位点)R-CS01 5’AAATTTAAATCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含Swa I位点)L-CS02 5’AATCTAGATTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Xba I位点)
R-CS02 5’AAGGATCCCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含BamH I位点)7)获得的质粒pFGC5941-CS-intron-CSr经Asc I/Xba I双酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(与Asc I是同尾酶)/Xba I双酶切的包含多角体基因(ph)的pFASTBacI-ph质粒(Invitrogen公司)，构建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
7)将pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr转化DH10Bac(包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌，Invitrogen公司)，获得包含CS双链干涉序列的重组NPV DNA，具体操作参照有关试剂说明。
8)并将重组NPV侵染草地叶蛾细胞株sf9(Invitrogen公司)，获完整重组NPV。
9)以不包含外源CS双链干涉序列的野生NPV为对照，比较重组病毒对尺蠖幼虫的侵染和毒杀能力的差异。具体做法为将上述培养获得的重组NPV以及野生NPV病毒配制成3×104PIB/ml溶液，将茶树叶片在病毒溶液中浸润后，自然风干后分别饲喂3龄尺蠖幼虫(每个处理30头尺蠖，重复3次)，定时进行观察并统计尺蠖死亡情况。结果显示，含CS双链干涉序列的重组病毒侵染尺蠖后，潜伏期缩短1倍以上，茶尺蠖感染前期死亡率超过对照50％以上。
说明上述方法构建的包含鳞翅目害虫几丁质合成酶双链干涉基因序列的重组NPV是成功的。
权利要求
1.鳞翅目害虫的高毒力核型多角体病毒构建技术，其特征在于如下步骤(1)鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)基因保守序列经克隆纯化后连接到pUcm-T载体并转化大肠杆菌，经抗性筛选获包含CS保守序列的pUCm-T载体(pUCm-T-CS)；(2)通过酶切和连接将CS插入双链干涉序列(dsRNAi)中间载体，获包含CS双链干涉序列的载体pFGC5941-CS-intron-CSr，经验证后转化大肠杆菌扩增；(3)将pFGC5941-CS-intron-CSr中间载体双酶切后获得的CS-intron-CSr序列插入包含多角体基因(ph)的pFASTBacI-ph质粒，构建pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr；(4)将pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr转化包含NPV DNA(Bacmid)和帮助质粒的大肠杆菌(DH10Bac)，获包含CS双链干涉序列的重组NPV；(5)将上述重组NPV侵染草地叶蛾细胞株sf9扩增，经筛选获高毒力重组NPV。
2.按权利要求1所述鳞翅目害虫的高毒力核型多角体病毒构建技术，其特征在于按本技术所获高毒力重组NPV应用于植物鳞翅目害虫的防治。
全文摘要
鳞翅目害虫的高毒力核型多角体病毒构建技术属于生物技术领域，涉及一种利用双链RNA干涉等现代分子生物学手段，改造野生核型多角体病毒(NPV)，构建鳞翅目害虫的高毒力NPV的技术。本发明的高毒力核型多角体病毒的构建技术包括以下步骤①尺蠖等鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)基因保守序列的克隆；②鳞翅目害虫CS基因dsRNAi中间载体构建；③包含CS双链干涉序列的NPV转移载体构建；④包含CS双链干涉序列的NPV重组，并通过PCR等方法对重组NPV进行验证。以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV。改造后的新型NPV对鳞翅目害虫具有更快的扩散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
文档编号C12N15/63GK1804030SQ20051006213
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者陆建良, 梁月荣, 张广辉, 林晨, 杜颖颖, 潘顺顺 申请人:浙江大学