肝脏型脂肪酸结合蛋白基因(l-fabp)作为猪肉质性状的分子标记及其应用的制作方法

专利名称：肝脏型脂肪酸结合蛋白基因(l-fabp)作为猪肉质性状的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，涉及猪肉质性状候选基因在标记辅助选择中 的应用，具体地说是一种肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)基因作为分子标记及在猪肉质 性状中的应用。
背景技术：
1972 年美国加利福尼亚大学的 Ocker 等[Ockner，R. K.，J. A. Manning, R. B.Poppenhanusen, and W.K. Ho. A binding protein for fatty acids in cvtosol of intestinal mucosa, liver, myocardium and other tissue. Science, 1972,177 :56_58.] 在大鼠的小肠黏膜发现了脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid-Binding Proteins，FABPs)，它广 泛存在于哺乳动物的小肠、肝、心、脑和骨骼肌的多种细胞内，并且含量丰富，占细胞内可溶 性蛋白总量的3% -8%。FABPs —般含有126-137个氨基酸，同时表现出38% -70%氨基酸 序列的同源性。2002 年Hanhoff 等[Hanhoff T, Lucke C, Spener F. Insights into binding of fatty acids by fatty acid binding proteins. Mol. Cell Biochem,2002,239(1-2) 45-54]研究发现FABPs有九种组织特异性的类型，分别是肝脏型脂肪酸结合蛋白(Liver FABP，L-FABP)、肠型脂肪酸结合蛋白(Intestinal FAB P，I-FABP)、心脏型脂肪酸结合蛋白 (Heart FABP, H-FABP)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte FABP, A-FABP)、表皮型脂 肪酸结合蛋白(Epidermal FABP，E_FABP)、回肠型脂肪酸结合蛋白(Ileal FABP，I1-FABP)、 脑型脂肪酸结合蛋白(Brain FABP, B-FABP)、髓磷脂型脂肪酸结合蛋白(Myelin FABP, M-FABP)和睾丸型脂肪酸结合蛋白(Testis FABP，T-FABP)。L-FABP在哺乳动物的肝脏和小肠组织中表达，在人的肾脏中也有少量表达，Hera 等(2003)[Hera GM,Chinaga CC,Cheb WY,Wu JL. In vivo studies of liver-type fatty acid binding protein (L-FABP) gene expression in liver of transgenic zerbrafish. Elsevier Science BV2003 ；13 125-133]和 Gertow 等(2004) [Gertow K, Bellanda Μ, Eriksson P, et al. Genetic and structural evaluation of fatty acid transport protein-4in relation to markers of the insulin resistance syndrome. J Clin Endocrinol Metab，2004，89 392-399]研究发现L-FABP为长链脂肪酸和极长链脂肪酸摄 取和转运所必须。2003 年 Newbeny 等[Newbeny EP, Xie Y, Kennedy S, et al. Decreased hepatic triglyceride accumulation and altered fatty acid uptake in mice with deletion of the liver fatty acid binding protein. J Biol Chem 2003,278: 51664-51672.]发现L-FABP基因敲除的大鼠，其脂肪酸转运明显降低。# M [JIANG Yan-Zhi, LI Xue-ffei, YANG Guang-Xi. Sequence Characterization, Tissue-specific Expression and Polymorphism of the Porcine(Sus scrofa)Liver-type Fatty Acid Binding Protein Gene. Acta Genetica Sinica. 2006,33(7) 598-606]等利用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR技术，克隆到猪肝脏型脂肪酸结合蛋白基因(L-FABP)的全长cDNA序列518bp (GenBank登录号AY960623) 和部分基因组序列(GehBank登录号DQ182323)。猪L-FABP基因与其他FABPs基因一样， 由4个外显子(67bp、173bp、93bp和51bp)和3个内含子组成，内含子1和3的大小是1679 饰和565bP，没有获得内含子2的序列，外显子和内含子剪接处符合GT/AG规律。分析还发 现，所克隆得到的编码区核苷酸序列与已知猪L-FABP基因的编码区核苷酸序列存在一定 的变异，分别是外显子2中T — C (116位)、C — T (231位)、C — A (236位)和A — C (258 位)，演绎成氨基酸在Leu74Met存在差异。为进一步证实这些突变位点在猪群中真实存在， 利用PCR-SSCP检测方法对4个猪种(藏猪、大河猪、雅南猪和约克夏)的157头个体的外 显子2全序列进行SNP位点多态性片段的基因型分型，结果发现一个C — T的单核苷酸多 态性，等位基因频率在中国地方猪种(藏猪、大河猪、雅南猪)与国外约克夏猪种间存在极 显著的差异。连锁分析发现，基因型CC的肌内脂肪含量(4. 86士0.22%)显著的高于基因 型CT(4. 16士0.22% )和ΤΤ(4·05士0.27% )的肌内脂肪含量。因此，推测L-FABP基因可 能是影响猪肌内脂肪含量的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因，并且能够在分子 标记辅助选择中用于对猪肌内脂肪含量的遗传改良。

发明内容
本发明的目的是提供一种肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)基因作为猪肉质性状 的分子标记。本发明在于获得与猪肉质性状相关的L-FABP基因部分片段，并对该片段进行 多态性分析，为猪的标记辅助选择提供分子标记。本发明的另一个目的是提供鉴定作为猪分子标记的L-FABP基因的PCR-SSCP检测方法。本发明的第三个目的是提供所涉及的分子标记在猪肉质性状关联分析上的应用。本发明通过以下技术方案实现。一种克隆得到的猪肝脏型脂肪酸结合蛋白基因(L-FABP)片段，它的核苷酸序列 如表1 表1猪肝脏型脂肪酸结合蛋白基因(L-FABP)克隆片段 CCCCTCAGCCTCCAATGCCTTTCA ■ CAGGTCTGCCCGACGAACACATCCAGAAGGGGAAGGACATC AAGGGGACATCGGAAATCGTGCAGAATGGGAAGCACTTCAAGTTGACCATCACTACCGGGTCCAAGGTCGTCCAGAA TGAGTTCACCTTGGGAGAGGAGTGTGAGATGGAGACCCTGACTGGGGAGAAGGTCAAG其中，_为此序列片段中突变位点的两种单核苷酸，该序列中只存在T或C的一 种。所获得的L-FABP基因片段的核苷酸序列长度为201bp，是内含子1和外显子2的 一部分。序列表1的第25位碱基处存在有一个碱基突变，导致单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism)的产生。将此突变位点作为一个分子标记， 通过PCR-SSCP的方法检测此突变位点，并将检测结果与猪肉质性状相关联，为猪的选种选 育提供实验基础和理论依据。本发明的分子标记鉴定方法和性状关联分析过程如图11所示。本发明的分子标记鉴定方法，通过下述步骤实现
一、猪L-FABP基因目的片段的获得1.采集猪血液活体或肉质测定时进行血液采集。为在后续实验中便于从血液中提取基因组DNA， 应使用EDTA抗凝血法进行处理，而不使用肝素抗凝血法。2.从猪血液中提取基因组DNA及电泳检测 将采集的血液经EDTA抗凝血法处理后，使用AXYGEN公司的AxyPr印TM Multisourse Genomic DNAMiniprep Kit试剂盒提取基因组DNA。具体操作步骤如下将 猪冰冻血样室温融化，用手术剪将其剪碎；加入350 μ 1 Buffer PBS和0. 9 μ IRNaseA ；收 集350 μ 1剪碎的血样组织并转入2ml离心管；如体积不足350 μ 1，补充PBS至350 μ 1 ；加 Λ 150 μ IBuffer C-L和20 μ 1 Proteinase K，立即漩涡震荡Imin混合均勻，短暂离心后， 将离心管置56°C水浴IOmin ；加入350 μ 1 Buffer P_D，漩涡震荡30s混合均勻，12000 Xg 离心IOmin ；将DNA制备管置于2ml离心管中，然后把混合液移至制备管中，12000X g离心 Imin ；弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500 μ 1 Buffer Wl，12000Xg离 心Imin ；弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700 μ 1 Buffer W2,12000 Xg 离心lmin，以同样的方法，用700 μ 1 Buffer W2再洗涤一次；弃滤液，将制备管置回到原来 的2ml离心管中，12000 Xg离心Imin ；将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制 备管的膜中央加100-200 μ 1 Eluent或去离子水，室温静置lmin，12000 X g离心Imin洗脱 DNA。取5 μ 1待检测DNA样品和1 μ 1上样缓冲液混合均勻，上样于1.5%的琼脂糖凝胶 (含0. 05% ΕΒ)，同时上样DL2000Marker。120V电压电泳lOmin，紫外灯下观察电泳结果， 条带亮且清晰，并且无拖带现象，说明提取的基因组浓度及质量较好，可进行下一步实验操 作，如图1所示。3.设计特异性引物并进行PCR扩增利用软件01igo6. 0设计一对特异引物，引物序列上游引物 5，-CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3，，下游引物5，-CTTGACCTTC TCCCCAGTCA-3，，扩增片段长度 为201bp，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应总体系为50μ 1，其中IOX反应缓 冲液5μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，1. Oumol/L的上游引物和下游引物各1 μ 1，IU TaqDNA聚 合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50 μ 1。循环程序如下95°C预变性5min，95°C变性30sec，59°C复性45sec，72°C延伸 30sec，共35个循环。循环之后，72°C延伸lOmin。全部反应完成后，PCR扩增产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测。二、建立PCR-SSCP检测方法并鉴定突变位点本发明将PCR产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果检测到三种基因 型TT型、TC型和CC型，如图3所示，泳道3和6为TT型，泳道1，2，5，7为TC型，泳道4为 CC型。然后将两种纯合子TT型和CC型的目的片段克隆在PMD18-T载体上，而后转化重组 质粒，提取质粒进行PCR鉴定，最后把鉴定正确质粒的进行测序。三、对标记性状进行关联分析本发明通过肉质性状关联分析过程，对猪部分肉质性状进行关联分析并预测相应 基因型个体部分肉质性状的潜力。肉质性状关联分析过程，是通过下述步骤实现的。
使用SPSS 13. 0软件中的General Linear Model过程，建立如下统计分析模型并 消除系统效应来分析不同基因型和部分肉质性状的关联。统计分析模型为=Yi = μ +G,ei。其中，Yi为被观测个体的肉质性状表型值，μ为 肉质性状的最小二乘均值，G^为基因型对肉质性状的效应值，e,为对应于观察值的随机残差。对猪第1内含子的多态性位点与肉质性状进行关联分析，基因型检测结果表明在 156个个体中TT型基因型有48个，TC基因型个体有82个，CC型基因型个体有26个。分析 结果如表2所示，其中，同一性状最小二乘均值及标准差后具有不同字母表示差异显著(P < 0. 05)，具有不同小写字母表示差异极显著(P < 0. 01)。由表2可知，C等位基因是猪肉 质性状的有利等位基因，CC基因型标记可作为用于提高猪大理石纹和肌间脂肪含量的选择 标记(分子标记)，并对一些性状提出预测值，最小二乘均值士标准差即为对同一或不同品 种猪肉质性状。将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR-SSCP的方法鉴定此突变位点， 并将鉴定结果与猪肉质性状相关联，为猪的选种选育提供理论基础。利用本发明建立的PCR-SSCP方法即可检测任何品种的猪L-FABP基因型并进行评 估，提出部分肉质性状的估测值。本发明的效果是如下1.获得猪L-FABP基因目的片段用本发明设计的特异性引物扩增猪基因组DNA，得到201bp特异扩增片段。利用 PCR技术对目的片段进行体外扩增，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特 异性PCR产物，如图2所示。测序结果显示该多态性片段存在T、C两个等位基因，然后将两 种纯合子TT型和CC型的目的片段克隆在pMDIS-T载体上，而后转化重组质粒，提取质粒进 行PCR鉴定，最后把鉴定正确质粒的进行测序，测序峰图如图4所示。2.建立了猪L-FABP基因单核苷酸多态性PCR-SSCP诊断方法扩增的目的片段与去离子甲酰胺混合，接着95°C变性解链，再在冰水中骤冷快速 复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳；最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。结果可产生三种基因 型，即TT型、TC型和CC型，具体基因型如图3所示。3.对标记性状进行关联分析本发明运用SPSS13. 0软件中的General Linear Model过程，将不同基因型与156 头猪的肉质性状进行关联性分析，分析性状包括部分肉质性状。分析结果见表2，分析结果 表明此多态性对所检测的猪大理石纹有显著影响(P < 0. 05)，而对肌间脂肪含量(IMF)有 极显著影响(P < 0. 01)，大理石纹为CC型显著高于TC型(P < 0. 05)，TC型显著高于TT型 (P < 0. 05) ；IMF含量为CC型和TC型极显著高于TT型(P < 0. 01)，而CC型和TC型之间 差异不显著(P > 0. 05)；其它肉质性状的不同基因型之间差异不显著(P > 0. 05)。表2部分肉质性状在TT、TC和CC基因型的最小二乘平均值及标准差


图1是血液基因组DNA经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分 子量Marker，1-6泳道为血液基因组DNA。图2是L-FABP基因扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标 准分子量DL2000Marker，1-7泳道为被检测的7个PCR产物。图3是L-FABP基因扩增产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图。泳 道3和6为TT型，泳道1，2，5和7为TC型，泳道4为CC型。图4是本发明扩增的L-FABP基因TT型和CC型DNA序列的克隆测序峰图。图5是实施例1中PCR扩增产物的1. 5%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标 准分子量DL2000Marker，1-2泳道为被检测的2个PCR产物。图6是实施例1中L-FABP基因扩增产物经12 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 结果图。泳道1为TC型，泳道2为TT型。图7是实施例2中PCR扩增产物的1. 5%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标 准分子量DL2000Marker，1-2泳道为被检测的2个PCR产物。图8是实施例2中L-FABP基因扩增产物经12 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 结果图。泳道1为TC型，泳道2为CC型。图9是实施例3中PCR扩增产物的1. 5%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标 准分子量DL2000Marker，1-2泳道为被检测的2个PCR产物。图10是实施例3中L-FABP基因扩增产物经12 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 结果图。泳道1为TT型，泳道2为TC型。图11是本发明的分子标记鉴定方法和性状关联分析过程图。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式
详细描述具体内容。本发明利用已公布的L-FABP基因序列和已提取的猪基因组DNA，设计特异性引物 一对，克隆内含子1和外显子2的一部分大约201bp，利用PCR-SSCP方法进行检测，将非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分型并将不同基因型与肉质性状关联，并对不同基因型个体的 部分性状预测，为猪的选种选育提供理论基础。一、猪L-FABP基因目的片段的克隆1引物设计以猪 L-FABP 基因为参照，NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)收录号为DQ182323，利用01igo6. 0软件设计1 对特异性引物。引物序列如下所示上游引物5，-CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3，下游引物5，-CTTGACCTTCTCCCCAGTCA-3，扩增产物长度为201bp，引物由上海生物工程有限公司合成。
2PCR(聚合酶链式反应)体系及扩增条件PCR反应总体系为50μ 1，其中10X反应缓冲液5μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4μ 1, l.Oumol/L的上游引物和下游引物各1μ 1，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后 用四馏水补足至50 μ 1。循环程序如下95°C预变性5min，95°C变性30sec，59°C复性45sec，72°C延伸 30sec，共35个循环。循环之后，72°C延伸lOmin。全部反应完成后，PCR扩增产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果显示为特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子 量Marker DL2000,1-7泳道为被检测的7个PCR产物。二、PCR-SSCP 方法的建立112%非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳首先清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用琼脂糖封闭玻璃 板和胶条间的缝隙，为彻底将缝隙密封需在室温下静止30min再次补充的琼脂糖；在 100ml烧杯内加入30%丙烯酰胺12. 0ml, 5. Oml的50%甘油，5XTBE 10. 0ml, 10%过硫酸铵 350 μ 1, TEMED 8 μ 1，加入双蒸水13. 0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1. Ocm 时停止灌胶，插入梳子后再继续灌胶至玻璃板上沿，室温聚合30min，随时观察凝胶聚合情 况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，向电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗加样孔；在4°C下 130V预电泳lOmin，同时准备点样；取1 μ 1 PCR产物置于PCR管中，加5 μ 1变性Buffer， 离心混勻，98°C变性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射器点样；打开电源，4°C下130V电 泳14 16h。2硝酸银染色电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡 器缓慢摇勻固定10 15min ；去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染 色30min ；去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，约10 30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，扫描照相或保存。在该对引物的第25bp位置存在T/C等位突变，从而导致单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism)白勺产生。当i亥位为 T 喊基时，经 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果带型为2条带，这2条带分别位于最上方和最下方；当该 位点为C碱基时，经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果带型也为2条带，但带型与T碱基时不同，其下面1条带位置位于T碱基时的上方；当杂合子是为3条带；如图3所示，其 中3和6泳道为TT型，1，2，5和7泳道为TC型，4泳道为CC型。三、多态性片段的回收、纯化及测序IPCR扩增产物的凝胶回收、纯化本发明中对2个纯合子即TT基因型和CC基因型的PCR扩增产物进行回收、纯化 和测序，凝胶回收和纯化使用常规方法即可。本发明中为快速、高效的回收PCR扩增产物， 使用Axygen公司AxyPr印基因组DNA小量试剂盒，具体操作参照其说明书进行，使用试剂 除IXTAE Buffer缓冲液和二馏水外均为试剂盒内提供。在新鲜的IXTAE Buffer下，用 2.0%琼脂糖/溴化乙啶凝胶电泳完全分离目的DNA片段。在长波紫外灯下用洁净的手术刀 片快速切取含目的DNA片段凝胶条。在干净的1. 5ml离心管中称量所切胶块的重量，计算 胶块的体积(按Ig为Iml计算，为保证回收量，回收的胶块重量应在50mg至350mg之间)， 加1 3体积的Extraction Buffer, 55°C _65°C孵育7min或直到胶块完全融化，每2_3min 摇动一次混合均勻；按1 1的比例(凝胶质量毫克数异丙醇体积微升数)加入异丙醇， 并混合均勻。将混合液全部转移到Spin column内，于6000g离心一分钟，并弃去接液管内 液体。向 Spin column 内力卩 500 μ 1 Extraction Buffer，于 12000g 离心 30_60sec，并弃去 接液管内液体。向 Spin column 内力口 750 μ 1 Wash Buffer，于 12000g 离心 30_60sec，并弃 去接液管内液体。弃滤液，将空的Spin Column 12000g离心lmin，然后将Spin Column放 入一个干净灭菌的1. 5ml离心管中。向Spin Column内加30 μ 1 Elution Buffer或灭菌 的去离子水到柱子的中央，并于室温静置一分钟。12000g离心Imin洗脱DNA。2感受态DH5 α宿主菌的制备用CaCl2法制备大肠埃希氏DH5 α (Ε. coli DH5 α )感受态宿主菌，整个过程需在严 格的无菌条件下进行。方法如下从37°C培养16至20h的LB(Luria-Bertani)平板培养基 中挑取新活化的E. coli DH5a单菌落于不加氨苄的LB液体培养基中，37°C每分钟200至 220转振荡培养12h，然后取300微升于50 μ 1装有LB的锥形瓶中，柔和摇晃2h，OD600值为 0. 45至0. 55。取冰中预冷IOmin的E. coli DH5 α菌液于冰上预冷的离心管中，在4°C下 每分钟4500转的转速离心lOmin。取25ml冰浴预冷的0. 075Mol/L的CaCl2-Tris-Cl悬浮 沉淀，置于冰浴15min。在4°C下每分钟4500转的转速离心lOmin，弃上清液后，倒置lmin。 加2ml冰浴预冷的CaCl2-甘油重悬沉淀。每管200 μ 1分装至1. 5ml离心管内，在_80°C保 存。3目的片段与克隆载体的连接可根据实际情况选择合适的载体。本发明为快速、高效的进行载体连接，选用了 TaKaRa公司的pMD18_T载体连接试剂盒进行目的片段与克隆载体的连接，除四馏水外，其 他所有试剂均为试剂盒内提供。将凝胶回收的目的DNA片段连接到pMD-18T载体上。按照 表3的连接反应体系，在200 μ 1高压灭菌的微量离心管中加入表3中所列的组分，混勻， 16°C 连接 12-16h。表3连接反应体系 4重组质粒的转化在每管200 μ 1冰上冻融的感受态细胞中，加入10 μ 1的连接产物，轻弹管壁以混 勻内容物，冰浴45min。将离心管放入预热的42°C恒温水浴中静置2min。快速将离心管转 移到冰中，冰浴5min。在离心管中加入200 μ 1 LB液体培养基，37°C摇床每分钟150转的转 速温浴1. 5h。5阳性克隆的筛选将LB固体培养基15psi(1.05kg/cm2)高压蒸汽灭菌20min，冷却至60°C时，加 入lmllOOyg/y 1的氨苄青霉素(AMP)Uml 24 μ g/ μ 1的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、2 μ 1 20 μ g/ μ 1的5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-Gal)后均勻混合，铺制 平板。取100 μ 1转化后的细菌均勻涂布于培养基表面，37°C培养箱中放置lh。然后将平板 倒置于37°C培养箱中培养，12-16h后将平板移入4°C放置，以使蓝色充分显现。观察蓝色 与白色菌落生长情况，为使每条目的带的转化产物覆盖5’和3’末端全序列，挑取阳性菌落 (白色)5-10个接种于LB培养基。6重组质粒的提取可使用常规方法进行重组质粒的提取。本发明为快速、高效进行重组质粒的提 取，选用Omega公司的E.Z. N. A. Plasmid Mini Kit I试剂盒提取阳性质粒DNA，除四馏 水、去离子水外，所用试剂均为试剂盒内提供。从平板培养基上挑选单个阳性菌落接种到 5ml 50 μ g/ml的LB/Ampicillin液体培养基中，37°C每分钟220转的转速恒温振荡，培养 12-16h。取5ml菌液放入离心管中，室温IOOOOg离心lmin，弃掉上面的上清液。用250 μ 1 的含RNA去除酶的Solution I充分悬浮细胞沉淀。加入250 μ 1的Solutionll，轻轻地 上下翻转混合4 6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液，室温放置2min。加入350 μ 1的 Solutionlll，轻轻上下翻转混合5至6次，直至形成紧实凝集块，室温IOOOOg离心lOmin。 将试剂盒中的HiBind DNAMinicolumn放置于2ml的Collection Tube上，将上述带有凝 集块混合液的上清液转移至HiBind DNA Minicolumn中，室温IOOOOg离心lmin。弃掉滤 液，加入 500 μ 1 的 Buffer HB 到 HiBind DNA Minicolumn,然后室温 IOOOOg 离心 lmin。 离心完毕后弃掉滤液，加700μ 1用乙醇稀释过的DNA Wash Buffer清洗HiBind DNA Minicolumn,室温IOOOOg离心lmin,弃掉滤液。然后室温IOOOOg离心空的HiBind DNA Minicolumn lmin，干燥基质。干燥完毕后将HiBind DNA Minicolumn安置于新的灭菌过 的1. 5ml的离心管上，在HiBind DNAMinicolumn中的膜的中央处加入60 μ 1灭菌的去离 子水，室温静置Imin后，IOOOOg离心Imin洗脱DNA，可以再洗脱一次提高产量，在-20°C贮 存。7阳性质粒的PCR鉴定及测序以重组质粒为模板进行PCR鉴定，反应体系及扩增条件不变，将鉴定正确的重组 质粒送测序公司进行序列测定。本发明中，重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公 司测序。
四、对标记性状进行关联分析利用已测定肉质性状的156头猪基因组DNA样品(基因组DNA提取自血液)，对标 记性状进行关联分析，分析性状包括肉质性状。运用SPSS13. 0软件中的General Linear Model过程，建立如下模型并消除系统效应来分析不同基因型和性状间的关联。统计分析模型为=Yi = μ +G广ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值；μ为 生产性能的最小二乘均值&为基因型对生产性能的效应值&为对应于观察值的随机残 差。实施例1在中国吉林省农业科学院畜牧分院的大白猪中随机抽取2个6月龄的个体，在肉 质测定时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA 经分光光度仪测定，浓度为37. 19ug/ml, 0D260/0D280Ratio为1. 816。利用本发明设计的 引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50 μ 1，其中IOX反应缓冲 液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1，0.1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ l,25mmol/L MgCl23 μ 1，引物浓度为1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1 μ 1，1 μ 1 (2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因组DNA(含31. 68ng基因组DNA)，四馏水36 μ 1。PCR反 应条件为95°C预变性5min，95°C变性30sec，59°C复性45sec，72°C延伸30sec，共35个循 环。最后，72°C延伸lOmin。全部反应完成后，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果 显示为特异性PCR产物。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和2为被检 测的2个PCR产物。将PCR产物按本发明设计的SSCP方法进行检测。取Ιμ PCR产物置 于PCR管中，加5μ 1变性Buffer，离心混勻，98°C变性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器点样于事先配制好的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶点样孔中；打开电源，4°C下130V电泳 14 16h。电泳结束后取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇勻固定10 15min ； 去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去离子水洗胶3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，约10 30min，当DNA带的强度合适 时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，扫描照相或保存，并记录其基因型。如图6所 示，其中泳道1和2为被检测2个个体的SSCP结果。经鉴定，此泳道1个体属于TC型，泳 道2个体属于TT型。其性状与本发明所预测的值的对比见表4。表4实施例1中抽取的个体性状测量值与预测值对比 实施例2在吉林大学原种猪场中饲养的长白猪中随机抽取2个5月龄的个体，在肉质测 定时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经 分光光度仪测定，浓度为36. 37ug/ml, 0D260/0D280Ratio为1. 806。利用本发明设计的 引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50 μ 1，其中IOX反应缓冲 液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1,0. 1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ 1，25讓ol/LMgCl23y 1，引物浓度为1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1μ 1，1μ 1(2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因组DNA(含31. 68ng基因组DNA)，四馏水36 μ 1。PCR反 应条件为95°C预变性5min，95°C变性30sec，59°C复性45sec，72°C延伸30sec，共35个循 环。最后，72°C延伸lOmin。全部反应完成后，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果 显示为特异性PCR产物。如图7所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和2为被检 测的2个PCR产物。将PCR产物按本发明设计的SSCP方法进行检测。取Ιμ PCR产物置 于PCR管中，加5μ 1变性Buffer，离心混勻，98°C变性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器点样于事先配制好的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶点样孔中；打开电源，4°C下130V电泳 14 16h。电泳结束后取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇勻固定10 15min ； 去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去离子水洗胶3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，约10 30min，当DNA带的强度合适 时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，扫描照相或保存，并记录其基因型。如图8所 示，其中泳道1和2为被检测2个个体的SSCP结果。经鉴定，此泳道1个体属于TC型，泳 道2个体属于CC型。其性状与本发明所预测的值的对比见表5。表5实施例2中抽取的个体性状测量值与预测值对比 实施例3在吉林大学原种猪场饲养的军牧1号白猪中随机抽取2个7月龄的待肉质个体， 在肉质时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA 经分光光度仪测定，浓度为37. 53μ g/ml，0D260/0D280比率为1. 834。利用本发明设计的 引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50 μ 1，其中IOX反应缓冲
12液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1，0.1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ l,25mmol/L MgCl23 μ 1，引物浓度为1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1 μ 1，1 μ 1 (2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因组DNA(含31. 68ng基因组DNA)，四馏水36 μ 1。PCR反 应条件为95°C预变性5min，95°C变性30sec，59°C复性45sec，72°C延伸30sec，共35个循 环。最后，72°C延伸lOmin。全部反应完成后，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果 显示为特异性PCR产物。如图9所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和2为被检 测的2个PCR产物。将PCR产物按本发明设计的SSCP方法进行检测。取Ιμ PCR产物置 于PCR管中，加5μ 1变性Buffer，离心混勻，98°C变性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器点样于事先配制好的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶点样孔中；打开电源，4°C下130V电泳 14 16h。电泳结束后取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇勻固定10 15min ； 去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去离子水洗胶3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，约10 30min，当DNA带的强度合适 时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，扫描照相或保存，并记录其基因型。如图10 所示，其中泳道1和2为被检测2个个体的SSCP结果。经鉴定，此泳道1个体属于TT型， 泳道2个体属于TC型。其性状与本发明所预测的值的对比见表6。表6实施例3中抽取的个体性状测量值与预测值对比 SEQUENCE LISTING<110>吉林大学<120>L-FABP<130>L-FABP<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>201<212>DNA<213>Sus scrofa
<220>
<221>misc_feature
<223>n
<400>1
cccctcagcctccaatgcctttcatcaggt ctgcccgacg aactcatcca gaaggggaag
gacatcaaggggacatcggaaatcgtgcag aatgggaagc acttcaagtt gaccatcact
accgggtccaaggtcgtccagaatgagttc accttgggag aggagtgtga gatggagacc
ctgactggggagaaggtcaag
60 120 180 20权利要求
猪L FABP基因作为肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQUENCELISTING所述，在序列表的第25bp处(内含子1处)有一个T→C的碱基突变，从而导致了单链构象多态性的产生。
2.检测权利要求1所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示 正向引物5 ~ -CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3 “，反向引物5 ~ -CTTGACCTTCTCCCCAGTCA-3 “。
3.权利要求1所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪分子标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的分子标记的制备及应用，所述的猪肉质性状涉及肌间脂肪含量，眼肌面积，熟肉率，滴水损失和肌纤维直径等相关性状。本发明制备的分子标记从猪L-FABP基因中克隆得到，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQUENCE LISTING所示，在序列表SEQUENCE LISTING的第25bp处(内含子1处)有一个T→C的碱基突变，从而导致了单链构象多态性的产生。本发明还公开了扩增L-FABP基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK101921845SQ20101023008
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月18日 优先权日2010年9月18日
发明者刘殿峰, 姜昊, 孙博兴, 张嘉保, 张树敏, 张永宏, 袁宝, 赵志辉, 马腾壑, 高妍 申请人:吉林大学