专利名称：人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
1、心肌组织脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein; H-FABP)
(1). FABP的性质和特征
脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid Binding Protein; FABP)首先由Ockner等在 1972年研究大鼠的小肠脂肪酸吸收的调节时，在肠粘膜发现的一族同源性的小分 子细胞内蛋白质[1]。分子量为12-16KD，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、 心、脑、骨骼肌等多种细胞中[2]。已发现的FABPs包括心肌型(H-FABP)、小肠型 (I-FABP)、肝脏型(L-FABP)、脂肪细胞型(A-FABP)、脑细胞型(B-FABP)、肾脏型 (K-FABP)、骨骼肌型(S-FABP)、牛皮癣相关型(PA-FABP)及表皮型(E-FABP) 9种类 型[1-6]。 FABPs以其在组织中的分布而命名，在同一细胞中可分布多种FABPs，例 如在小肠内皮细胞上存在两种不同FABPs，即L--FABP和I-FABP， 二者具有29%的 同源性。不同型FABP的序列有较大的同源性[3]。其中H-FABP是一种可溶性细胞质 蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为14-15KD^，其中还有多个苏氨酸和赖氨酸， 缺少半胱氨酸，在其N末端有一个乙酰化的缬氨酸残基。H-FABP是一种酸性蛋白 质，其等电点(pl)为5.]。它特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可 溶性蛋白的4-8%。它在心脏及某些骨骼肌中含量丰富，心脏和骨骼肌中含有相同 类型的H-FABP，但是在心肌中它的含量比骨骼肌中要高几倍。每克湿重心肌含H-FABP约0.Smg。而每克湿重骨骼肌含H-FABP仅O. 14 mg[7]。 H-FABP在心肌组织中含 量(0.5mg/g)比肌红蛋白(2. 5mg/g)小5倍，但H-FABP在血浆中的参考浓度(2 ug/L)比肌红蛋白(32tig/L)大约低15倍W。
从人心肌中纯化的H-FABP，己制备出单克隆抗体，建立了非竞争夹心ELISA 法测定组织和血浆中的H-卜'ABP浓度。Glatz等[8]报告健康人血浆H-F/VBP水平为 (2. 1 ± 1. 1) u g/L，上限(鉴别值)为5 y g/L。
4H-FABP是新推荐的AMI的血浆生化标志物，其血浆动力学同肌红蛋白相似。 AMI后3小时内发现其血浆浓度升高，通常12 24小时内返回到正常，这就使 得H-FABP对早期评价或排除AMI成为一个有用的生化标志物。Glatz等[9]报告 83例AMI患者，在住院期间作了一系列检査，结果显示对層I的诊断灵敏度， H-FABP为78%, MY0为53%， CK-MB为57%。此外，MY0和CK-MB活性增加的患者， 99%也表现有H-FABP浓度增加。H-FABP还可以用作判断围手术期心肌损伤的指 标。Suzuki等f刚发现H-FABP在心肌再灌注后60分钟内立即出现高峰，远在CK-MB 和cTnT之前。因此，作为AMI早期诊断的一种更好的生化指标，H-FABP具有 更大的潜能。H-FABP正成为心血管疾病诊断的有效标志物^6' "-19]。FABPs能够与疏水性配体分子如长链脂肪酸(FA)、维生素(视黄醇)、视黄 酸、某些有机阴离子等发生特异性结合，是关键的脂肪酸载体蛋白。它可将FA 从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒的能量代谢体系之中， 使FA在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为肌肉收缩提供能量[浏。由 于各型FABP具有各自特异的抗原决定簇，可以通过免疫学方法将H-FABP与其它型 的FABP相区别，所以，随着FABP测定方法的研究和临床应用，FABP正成为很多疾 病诊断的有效标志物。H-FABP的生理效应是调控心肌细胞对FA摄取，酯化和氧化过程，维持细胞FA 的稳态，并且对心肌缺血和心肌缺血-再灌注(I/R)损伤具有保护作用。心肌缺 血时FA的P氧化和三羧酸循环被抑制，引发心肌能量代谢障碍，游离FA大量堆积。 再灌注时形成大量氧自由基，氧自由基和Ca离子可激活磷脂酶A，使细胞膜磷脂 分解形成溶血磷脂和花生四烯酸。由于缺血时花生四烯酸和溶血磷脂再酰化发生 障碍，使细胞游离FA的含量进一歩增加。游离FA是一种具有"去污剂"样作用的 表面活性物质，高浓度时使心肌细胞膜严重受损。近来研究表明心肌缺血-再灌 注(工/R)时细胞H-FABP大量丢失，使心肌细胞对游离FA，长链酯酰CoA (辅酶A) 的调控能力降低，从而促使再灌注损伤的发生。 (2). FABP的结构特点FABPs是多基因家族，大约有20个相同的成员。不同种属动物、不同组织FABPs 的结构有多种同型异构体[21]。 X衍射晶体分析它们的三级结构也很类似，有10个 反平行的P折叠桶和两个短的a螺旋[22]。尽管目前对哺乳动物FABPs结构有了很多了解，但对FABPs的生理功能尚缺乏足够的认识，据认为胞质FABPs参与FA的吸 收、转运和代谢[2()1。目前，采用X线或醒R技术己经知道了人、牛、兔、昆虫等的FABPs的三维结 构，并得到了牛FABPs在溶液中的结构。对人FABPs而言，其蛋白的折叠与其它型 的FABPs极其相似十条反平行的链排列形成一蛤壳形结构，其顶端有两a螺旋 紧紧相邻，从而使其内部形成一较大的空腔，用以容纳和保护其内的FA^'^， 使之与外界环境相隔离。如图1所示。在空腔内部，FA的羧基头与蛋白质的带电 基团或极性基团通过静电或氢键间的相互作用而被固定，同时FA的非极性尾与蛋 白质的疏水基团发生相互作用而被固定。此空腔与外界环境通过一狭长的开口相 连，据研究，这个壳口是由蛋白质的侧链残基Va1-25、 Thr-29、 Phe-57、 Lys-58、 Ala-75形成的，且在口边上存在一正电荷(Lys-58)。人们猜想这一正电荷可以 将腔外带负电荷的FA吸引到腔内i13]。但是仅靠这一点要想使FA轻易地进入这个 小口是不可能的，必须还要有蛋白质分子的动态重排。此外,FABPs的D链和E链可 以形成第二个有效的小口。研究表明，这两条链与形成桶状结构的其它链一样， 不通过氢键直接相连，而是通过侧链与侧链间的相互作用及水分子与主链原子间 形成键桥保持联系。由于两链间充满了溶剂分子，所以第二个区域不能成为一个 真正的口。由动力模拟实验得来的结果表明，这一区域相当灵活[14]。由此人们 提出假说，即这一区域能够进行拉链式的活动以拓宽现有的小壳口。并且这种活 动不能使桶状结构的氢键网络断裂，而是能够使配体与溶剂分子进入内腔[15]。FABPs结合FA分子甲基，并限制FA分子移动的重要功能单位是一个由a螺旋、|3 片层所组成的"开口"结构，当此结构域与FA结合后，由7个氢链所组成的静电 网以及分子间范德华力的作用使得FA分子构象改变而被固定在FABPs分子内。 FABPs "开口"结构在与FA结合的同时也与一个由Aspll、 Asp34等组成的离子通 道相耦联，在特定的条件下通过这一离子通道的调节作用而结合或释放FA分子 [3]。这种结构决定了FABPs能够结合各种类型FA，在FA的摄取、转运及代谢调节 中具有重要作用。调节FA代谢是各型FABPs的共同作用，但在不同组织、不同条件下各型FABPs 的存在状况及活性均有所不同。例如H-FABP特异地存在于心肌组织中，约占心 脏全部可溶性蛋白质的4-8%， H-FABP与心肌细胞内的长链脂肪酸相结合，将其从细胞质膜向脂化和氢化部位运输，从而进入能量代谢体系，氧化分解最终生成 三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收縮提供能量。调节FA代谢是各型FABPs的共同作用，但在不同组织、不同条件下各型FABPs 的存在状况及活性均有所不同。例如H-FABP特异地存在于心肌组织中，约占心 脏全部可溶性蛋白质的4-8%， H-FABP与心肌细胞内的长链脂肪酸相结合，将其从细胞质膜向脂化和氢化部位运输，从而进入能量代谢体系，氧化分解最终生成 三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收縮提供能量[5]。 (3). H-FABP的临床应用应用于急性心肌梗塞(AMI)的早期诊断^'14'23-26] 应用于急性心肌梗塞(AMI)的再灌注判断。7'28]应用于推测急性心肌梗塞(AMI)的梗塞面积[29'30]监测急性心肌梗塞(AMI)的复发[8]应用于急性心肌梗塞(AMI)以外的心血管疾病[31'划2、外源蛋白质表达系统随着生物化学和分子生物学技术的发展，使人们得以更深入地了解蛋白质分 子的一级和二级结构，这样就可以有目的的进行改造，创建新的有价值的蛋白质 分子。为此,各种不同的原核、真核外源蛋白表达体系应运而生,如大肠杆菌表达 系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。这些表达 系统为我们研究高纯度重组蛋白质的应用发挥了重要作用，为生物医药市场提供 大量的重组蛋白质。各种原核、真核蛋白表达体系的特性比较见表l。Tabl: The comparison of characteristics of prokaryon and eucaryon表达体系优缺点師原核体系只有良好的口r操作性,成本低。但小能进行外源蛋lH 10-70%胞内表达，大肠杆菌糖埃化修饰，细胞内形成包涵体0.3-4%胞外表込。真核体系兼距原核体系良好的oj操作件和真核体外源蛋白占菌体蛋白10%酵母系的后加工能力。但存在产量低和过度糖基化问题。甲醇营养第一:代酵母表达系统，部分克服过度糖外源蛋白占菌体蛋白10-30%型酵母 化缺点，有较好的分泌性，产量较高，但产物结构'J天然分T仍有一些差异。昆虫细胞具有高等真核生物表込系统的优点，产酵液中表达产物1-500mg/L物的抗原性、免疫原性4天然蛋白质相似，表达水平较高，但糖基化程度较低，形式单一。哺乳动物产物的抗原性、免疫原性'j天然蛋白质酵液中表达产物0. 2-200mg/L细胞接近糖基化等后加T准确，但表达水平较低。(1).原核表达体系将克隆化外源基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的 方法一般称为原核表达。在众多外源蛋白质表达系统中，以大肠杆菌为宿主菌的 原核基因工程已成为最具吸引力的表达系统之一，这种方法广泛应用在蛋白纯 化、定位及功能分析等许多领域。外源基因置于大肠杆菌质粒特定的基因序列前 后可使外源基因得到正确的转录与翻译而成功表达。通常使用可诱导的启动子控 制蛋白的表达量，这在表达蛋白时尤其重要[34，34]。常用的细菌来源的启动子有lac启动子、trp启动子及两种启动子的杂和体。另一类常用的启动子为噬菌体 来源的启动子，如R启动子、T7RNA启动子，前者受温度控制，后者则用于严格控 制的两级放大表达。同时还必须给外源基因加上大肠杆菌核糖体结合位点,包括 起始密码子及其上游3-llbp处Shine Dalgarno序列以启动翻译。该表达系统 的主要特点1生长迅速、增代时间短、蛋白产量高。2表达蛋白的纯化、分离及分析快速，便于在短期内纯化、分析和使用这些表达 蛋白。3外源基因的导入相对容易生产，成本较低。 4已建立了整套表达理论及技术。 5操作简单，费用低廉。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典 型的表达载体应具有以下几种元件(1) 选择标志的编码序列；(2) 可控转录的启动子；(3) 转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；(4) 一个多限制酶切位点接头；(5) 宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下获得目的基因一准备表达载体一将目的基因插入表达载体中(测序验证)一转化表达宿主菌一诱导靶蛋白的表达一表达蛋白的分析、 纯化、进一步检测。原核表达系统是生产蛋白抗原的一种最为经济的手段，目前许多诊断试剂所用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但是在高效表达的同时，目的蛋白往往会形成 包涵体，这对蛋白的天然结构和抗原活性造成很大的破坏，而使包涵体中的变性 蛋白溶解和复性往往是一个非常费时且效率很低的过程，经常会导致重组蛋白的 大量损失。包涵体是指细菌高水平表达的蛋白在细胞内凝集，形成显微镜下可见 的固体颗粒。 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、 内毒素、外膜蛋白、环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5 lum，具有很高的密度，约1.3mg.ml/)，无定形，呈非水溶性，溶于高浓度变性 剂如尿素、盐酸胍等。剛R等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构， 可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。包涵体的产生主要是由于表达产物的不正确折叠所致，细菌中高效合成的目 的蛋白不能及时折叠，造成折叠中间物的聚集，从而形成包涵体。影响包涵体形 成的因素主要有细胞内伴侣蛋白(chaperone)和折叠酶(foldase)的活性、细菌 培养温度、目的蛋白的表达量、细胞内环境的pH值，此外还有一个重要因素， 那就是蛋白质的一级结构即氨基酸序列。蛋白质中某些氨基酸(尤其是半胱氨酸) 的改变可能会显著改变蛋白质的整体构象，从而使其容易受细胞内折叠机制的影 响而不能顺利进行折叠。Strandberg。"和Wetzel等[恥研究表明，重组蛋白中少 数氨基酸的改变可以大大改变表达产物的可溶性，而Rinas等人[37]的研究显示， 蛋白序列中某个半胱氨酸的改变即可改变整个蛋白分子的可溶性。大肠杆菌表达系统属于原核生物表达系统，缺乏真核生物蛋白质的加工与修 饰系统，无法对重组蛋白进行糖基化、正确折叠等蛋白翻译后的修饰、加工步骤， 在高水平表达时，疏水作用和离子作用、蛋白质的错误折叠及宿主细胞的还原性 环境、降解作用等都会导致重组蛋白形成无活性包涵体。同时，许多真核基因也 无法利用该系统进行生产。而且，利用大肠杆菌表达系统生产的重组医用、食用 蛋白，其热源性物质难以去除，人服用后易引起发烧等毒副反应[38]。pBV220是我国科学工作者自己构建的表达载体，使用了很强的PRPL双启动 子，含有编码温度敏感性阻遏蛋白的cI857基因，在30-32t:时产生的阻遏蛋白 能阻止PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，42摄氏度时该阻遏蛋白发生 构像变化而失活，基因开始转录而表达[39]。(2).真核表达系统真核表达系统包括酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞表达系统"1-42]。产生的 重组蛋白有水溶性高，可被翻译后加工，可被分泌等优点。但它们也具有价格高， 产量低等缺点(表1)。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养， 遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加 工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大 肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多 的重视和利用[43]。甲基营养型酵母包括Pichia、 Candida等。以Pichia. pastoris (毕赤巴 斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。 毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点[43—45];(1) 具有醇氧化酶A0X1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。(2) 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。(3) 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。(4) 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解， 而且减少对细胞的毒害作用。Pichia. pastoris基因表达系统经过近十年发展，己基本成为较完善的外源 基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使 产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 A0X1，已高效表达了HBsAg、 TNF、 EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多 种外源基因[45-47]，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物 生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模[别。 目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的C印helon 制剂己获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。Pichia. pastoris表达系统 在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表 达，提供更为广泛的基因工程产品[43'44]。毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组 蛋白进入分泌途径，可使蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对 外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pP:[CZ a A质粒，其信 号肽来自酿酒酵母的a-交配因子(a-factor),能很好的达到以上的要求。并 且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗 性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利[43' 44]。pPICZ a A质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介 如下(1) 具有强效可调控启动子A0X1 (alcohol oxidase,醇氧化酶)；(2) 具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即 在YPDZ平板上生长的转化子中，100%都有外源基因的整合，大大简化了重组转 化酵母的筛选过程[68]。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZ a A的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；(3) 在表达载体A0X1 5'端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点， 多克隆位点下游有A0X1 3'端终止序列；(4) 分泌效率强的信号肽a-factor. Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且有利于产物的纯化。 发明内容本发明的目的是提供一种人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5a中的表达和纯化，该发 明可获得大量重组人心肌型脂肪酸结合蛋白，为进一歩研究和开发应用人心肌型 脂肪酸结合蛋白奠定基础。 本发明的技术方案是 1、寡核苷酸引物根据GenBank(NM004012)的人H-FABP cDNA序列，设计编码H-FABP基因片 段的5'和3'端寡核苷酸引物，并在各自5'末端分别引入了EcoRI和Sall限制性酶切位点。引物序列如下正向弓l物5' - gcg aat tea tgg tgg acg ctt tc -3'; 反向弓l物5' -att. gtc gac tea tgc etc ttt etc-3'，2、 RT-PCR扩增及序列测定使用Invitrgen的Trizol总RNA提取试剂盒从人心肌组织中提出取总RNA， 提取方法按试剂盒说明操作。将RNA溶于50ul DEPC处理水，取10ul人心脏 总RNA(约10ug)加2ul Oligo-dT,置70°C 5rain,冰水中冷却5min，然后加 4dNTP(10mmol/L) 、 5ul AMV逆转录酶缓冲液、lul RNAase inhibitor(40u/u 1) 、 2yl AMV逆转录酶U0u/ul),最后加DEPC处理水至 终体积25ul，混合均匀，置42t:水浴90min， 95。C灭活5min。以上述逆转录的 cDNA 15ul为模板，加入上、下游引物，用ABI 2400热循环仪进行PCR扩增， 循环参数先变性94。C 5min，然后94°C 45s、 57°C 45s、 72°C lmin，循环30 次，最后在72"C延伸7min。 1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片 段。采用Promega的TA克隆试剂盒将PCR纯化产物克隆至pGEM-T easy载体， 构建克隆质粒pGEM-T-H-FABP，进行序列测定(大连宝生物工程公司)。3、 重组表达质粒的构建以EcoR I和Sal I双酶切pGEM-T-H-FABP质粒，切取脂肪酸结合蛋白片段， 与同样以EcoR I和Sal I双酶切的PBV220质粒连接，获得重组质粒PBV-H-FABP， 转化DH5ci感受态细胞，接种于LB固体培养基平板上(含50mg/L氨节青霉素)， 挑取数个菌落，接种于LB液体培养基中，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，酶 切鉴定，筛先出阳性克隆。4、 脂肪酸结合蛋白诱导表达挑取重组菌(PBV-H-FABP)接种于LB液体培养基中(含50mg/L氨苄青霉素)， 30°C ， 200rpm振摇过夜，次闩以1: 50接种至LB液体培养基中，继续在3(TC条 件下振荡培养，至OD卿值0. 4~0. 5，将温度调到42。C继续培养5小时。4。C ， 12000g 离心lmin，分别收集菌体和上清，菌体中加入缓冲液(50隱ol/L NaH2P04， 10mmol/L Tris-HCL， 250mmol/L NaCl)超声破碎，12000g离心，再分别取上清 和沉淀加入等量的2XSDS变性缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。鉴定出高表达质粒 并确定诱导表达条件。5、 人心肌脂肪酸结合蛋白的提取纯化将诱导表达的重组菌经-7(TC冰箱中反复冻融，离心收集上清。装入透析袋 中用PEG6000浓縮，上样Sephacryl S-100 HR和S印harose G-75柱，用pH7. 4 、 150mM NaCl 、 15mM磷酸钾缓冲液进行洗脱，速度仍为30ml/h。紫外检测仪灵 敏度为0. 2,记录仪走纸速度为3cm/h，量程为20mV。收集洗脱液，行SDS-PAGE 电泳。6、 Western blot将提取纯化的重组蛋白进行15% SDS-PAGE电泳，用半干式转移电泳仪转印 到硝酸纤维素膜，然后用BSA 4'C封闭过夜，洗膜，加入鼠抗人脂肪酸结合蛋 白单抗(Clone 6B6 ， 1: 1000)， 37。C反应1小时，洗膜，加入HRP标记的羊抗 鼠IgG (1: 1000)， 37。C反应l小时，DAB显色鉴定表达产物。7、 人H-FABP基因的扩增、克隆及测序以人心肌组织RNA为模板，用所设计的引物进行扩增，产物经1%琼脂糖凝 胶电泳分析，在约419bp处出现特异性条带，其大小与预期结果相符，见图3。 PCR产物纯化后，克隆入克隆载体，经PCR鉴定克隆成功。阳性克隆经LB扩大 培养后进行序列测定。测序结果表明我们采用的引物很好地扩增出人H-FABP 基因，H-FABP基因成熟肽编码区含有402bp ，编码134个氨基酸，与GenBank 中报道的人H-FABP分离物的核苷酸序列有99.9。/。同源性，。8、 重组表达质粒的构建及酶切鉴定pGEM-T-H-FABP质粒经EcoR I和Sal I双酶切后，获得脂肪酸结合蛋白片 段，插入同样经双酶切PBV220载体中，获得重组质粒PBV-H-FABP。经EcoR I和 Sal I双酶切及DNA序列测定对重组质粒进行鉴定，筛选出具有H-FABP基因cDNA 正向插入的重组质粒，酶切鉴定结果，见图4。9、 重组人H-FABP的诱导表达将表达菌株的单菌落接种在LB (50mg/L氨苄青霉素)液体培养基中，30 。C培养过夜，次日以l: 50接种量扩种，当菌液OD6oo达0.4 0.5时，将温度调 节到42匸，经5小时取样进行SDS-PAGE电泳。结果表明，经温度诱导后在相对 分子质量约14kD处出现明显的诱导蛋白条带，分子质量大小与预期一致，见 Fig.3。凝胶扫描分析显示，最佳表达状态时目的蛋白占菌体蛋白的20%。表达产物以可溶蛋白和包涵体形式存在。10、 重组人H-FABP的纯化 温度诱导下的菌液经-7(TC反复冻溶，离心收集上清，经PEG6000浓缩后，分别上SephacrylS-100HR和SepharoseG-75柱，用pH7.4 、 150mMNaCl 、 15mM磷酸钾缓冲液洗脱。纯化H-FABP的SDS-PAGE电泳分析。11、 Western blot印迹分析 为了确定表达的脂肪酸结合蛋白生物学特性，以鼠抗人脂肪酸结合蛋白单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹分析，结果可见诱导表达的菌体蛋白在！5kD处均呈现--条强的特异性反应带。 本发明的有益效果是1、 1996年Schaap F G等人在大肠杆菌中表达H-FABP以来，国内外先后有不同的表达报道[49-52本实验采用目前较常用的PBV220蛋白表达系统。PBV220表达 系统，它使用的是PJPK启动子，是噬菌体的阻遏物操纵系统。这个启动子受噬 菌体的阻遏基因cl编码的阻遏蛋白质的正控制。cl基因存在着一个温度敏感突 变等位基因，即Ci857基因。这个基因或是存在于大肠杆菌染色体上，或是存在 于相容性的质粒分子上，它所产生的一种阻遏蛋白在42t:时会被失活。当大肠 杆菌寄主细胞在42t:下生长时，它编码产生的阻遏蛋白质被破坏而失去活性， PL启子便启动转录合成出大量的mRNA;而在28-3(TC下培养时，cl基因则表 达出有活性的阻遏蛋白质，使PL启动子进入完全抑制状态。利用这一特性使 H-FABP蛋白在PBV220系统中得到表达。2、 在表达过程中我们进行了温度和时间的优化，在3CTC增菌，42'C条件下诱导 5小时得到高效表达。同时蛋白质以可溶性和包涵体两种形式存在。经过试验， 在-7CTC下反复冻融导致细菌的胀融，在菌体上清中有大量的可溶性脂肪酸结合 蛋白表达，这是其他大肠杆菌表达所没有的。此方法免去了分离包涵体的麻烦， 同时也避免了包涵体变性复性过程中蛋白质复性的不正确和不完全。3、 菌体上清中含细菌杂蛋白量较少且分子量大约在30KD以上，我们先采用 S印hacryl S-100 HR对菌体上清进行纯化，得到含有一 30KD的杂蛋白。又采 用S邻harose G-75柱除去此杂蛋白，这样得到了高纯的可溶性人H-FABP蛋白。 Western blot检测证明抗体特异性良好。重组人心肌型脂肪酸结合蛋白的成功 克隆与表达，为进一歩研究心肌型脂肪酸结合蛋白在疾病的诊断和疗效判定中的意义奠定了基础。
图1是本发明中H-FABP的立体结构图-图2是本发明中pBV220的物理图谱； 图3是本发明中H-FABP RT-PCR结果图； 图4是本发明重组表达质粒酶切鉴定图；具体实施方式
如图3所示，1: DNA标准DL2000+15000, 1: H-FABP PCR扩增结果；如图4所示，M. DNA标准DL2000+15000， 1. EcoR I和Sal I酶切pBV-H-FABP2. EcoR I禾卩Sal I酶切pBV-220 ， 3. pBV-H-FABP。实施例1:1、 质粒、菌株大肠杆菌(coJ/) DH5a菌株，pGEM-T easy, PBV220蛋白表达质粒。2、 工具酶及生化试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T叫DNA聚合酶，质粒DNA提出取试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒，人H-FABP单抗(Clone 6B6)，辣根过氧化物酶标记的二抗， RNAase inhibitor、 AMV逆转录酶，S印hacryl S-100 HR、 S印harose G-75。3、 寡核苷酸引物遵循PCR引物设计的原则，根据GenBank(NM004012)的人H-FABP cDNA序列， 设计编码H-FABP基因片段的5'和3'端寡核苷酸引物，并在各自5'末端分别 引入了 EcoR I和Sal I限制性酶切位点。引物序列如下正向弓i物5， - gcg aat tea tgg tgg acg ctt tc -3，； 反向弓i物5' -att gtc gac tea tgc etc ttt etc-3，，4、 RT-PCR扩增及序列测定使用Invitrgen的Trizol总RNA提取试剂盒从人心肌组织中提出取总RNA, 提取方法按试剂盒说明操作。将RNA溶于50wl DEPC处理水，取10ul人心脏 总RNA(约10ug)加2ul Oligo-dT，置70°C 5min,冰水中冷却5min，然后加 4"1 dNTP(10瞧ol/L) 、 5ul AMV逆转录酶缓冲液、lul RNAase inhibitor (40u/u 1) 、 2 y 1 AMV逆转录酶(10u/ul)，最后加DEPC处理水至 终体积25ul，混合均匀，置42。C水浴90min， 95。C灭活5min。以上述逆转录的 cDNA 15ul为模板，加入上、下游引物，用ABI 2400热循环仪进行PCR扩增， 循环参数先变性94。C 5min,然后94°C 45s、 57°C 45s、 72°C lmin，循环30 次，最后在72'C延伸7min。 1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。采用Promega的TA克隆试剂盒将PCR纯化产物克隆至pGEM-T easy载体， 构建克隆质粒pGEM-T-H-FABP，进行序列测定(大连宝生物工程公司)。5、 重组表达质粒的构建以EcoR I和Sal I双酶切pGEM-T-H-FABP质粒，切取脂肪酸结合蛋白片段， 与同样以EcoR I和Sal I双酶切的PBV220质粒连接，获得重组质粒PBV-H-FABP， 转化DH5a感受态细胞，接种于LB固体培养基平板上(含50mg/L氨节青霉素)， 挑取数个菌落，接种于LB液体培养基中，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，酶 切鉴定，筛先出阳性克隆。6、 脂肪酸结合蛋白诱导表达挑取重组菌(PBV-H-FABP)接种于LB液体培养基中(含50mg/L氨节青霉素)， 30°C， 200rpm振摇过夜，次R以l: 50接种至LB液体培养基中，继续在3(TC条 件下振荡培养，至OD,值0. 4 0. 5，将温度调到42。C继续培养5小时。4。C ， 12000g 离心lmin，分别收集菌体和上清，菌体中加入缓冲液(50聽ol/L NaH2P04， 10,ol/L Tris-HCL, 250咖ol/L NaCl)超声破碎，12000g离心，再分别取上清 和沉淀加入等量的2XSDS变性缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。鉴定出高表达质粒 并确定诱导表达条件。7、 人心肌脂肪酸结合蛋白的提取纯化将诱导表达的重组菌经-70'C冰箱中反复冻融，离心收集上清。装入透析袋 中用PEG6000浓縮，上样Sephacryl S-100 HR和S印harose G-75柱，用pH7. 4 、 150mM NaCl 、 15mM磷酸钾缓冲液进行洗脱，速度仍为30ml/h。紫外检测仪灵 敏度为0. 2,记录仪走纸速度为3cm/h,量程为20mV。收集洗脱液，行SDS-PAGE 电泳。8、 Western blot将提取纯化的重组蛋白进行15% SDS-PAGE电泳，用半干式转移电泳仪转印 到硝酸纤维素膜，然后用BSA 4'C封闭过夜，洗膜，加入鼠抗人脂肪酸结合蛋 白单抗(Clone 6B6 ， 1: 1000)， 37。C反应1小时，洗膜，加入服P标记的羊抗 鼠IgG(l: 1000)， 37。C反应l小时，DAB显色鉴定表达产物。
权利要求
1、一种人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化，其表达和纯化是a、寡核苷酸引物根据GenBank的人H-FABP cDNA序列，设计编码H-FABP基因片段的5’和3’端寡核苷酸引物，并在各自5’末端分别引入了EcoR I和SalI限制性酶切位点，引物序列如下正向引物5’-gcg aat tca tgg tgg acg ctt tc-3’；反向引物5’-att gtc gac tca tgc ctc ttt ctc-3’；b、RT-PCR扩增及序列测定使用Invitrgen的Trizol总RNA提取试剂盒从人心肌组织中提出取总RNA，提取方法按试剂盒说明操作，将RNA溶于50μl DEPC处理水，取10μl人心脏总RNA加2μl Oligo-dT，置70℃ 5min，冰水中冷却5min，然后加4μl dNTP、5μl AMV逆转录酶缓冲液、1μl RNAase inhibitor、2μl AMV逆转录酶，最后加DEPC处理水至终体积25μl，混合均匀，置42℃水浴900min，95℃灭活5min。以上述逆转录的cDNA 15μl为模板，加入上、下游引物，用ABI 2400热循环仪进行PCR扩增，循环参数先变性94℃ 5min，然后94℃ 45s、57℃ 45s、72℃ 1min，循环30次，最后在72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；采用Promega的TA克隆试剂盒将PCR纯化产物克隆至pGEM-T easy载体，构建克隆质粒pGEM-T-H-FABP，进行序列测定；c、重组表达质粒的构建以EcoR I和Sal I双酶切pGEM-T-H-FABP质粒，切取脂肪酸结合蛋白片段，与同样以EcoR I和Sal I双酶切的PBV220质粒连接，获得重组质粒PBV-H-FABP，转化DH5α感受态细胞，接种于LB固体培养基平板上，挑取数个菌落，接种于LB液体培养基中，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，酶切鉴定，筛先出阳性克隆；d、脂肪酸结合蛋白诱导表达挑取重组菌接种于LB液体培养基中，30℃，200rpm振摇过夜，次日以1∶50接种至LB液体培养基中，继续在30℃条件下振荡培养，至OD600值0.4~0.5，将温度调到42℃继续培养5小时，4℃，12000g离心1min，分别收集菌体和上清，菌体中加入缓冲液，超声破碎，12000g离心，再分别取上清和沉淀加入等量的2×SDS变性缓冲液，进行SDS-PAGE电泳；鉴定出高表达质粒并确定诱导表达条件；e、人心肌脂肪酸结合蛋白的提取纯化将诱导表达的重组菌经-70℃冰箱中反复冻融，离心收集上清。装入透析袋中用PEG6000浓缩，上样Sephacryl S-100HR和Sepharose G-75柱，用pH.4、150mM NaCl、15mM磷酸钾缓冲液进行洗脱，速度仍为3ml/H。紫外检测仪灵敏度为0.2，记录仪走纸速度为3cm/h，量程为20mV，收集洗脱液，行SDS-PAGE电泳。
全文摘要
一种人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化，属于生物技术领域，其表达和纯化是a.寡核苷酸引物；b.RT-PCR扩增及序列测定；c.重组表达质粒的构建；d.脂肪酸结合蛋白诱导表达；e.人心肌脂肪酸结合蛋白的提取纯化。本发明的有益效果是使PL启动子进入完全抑制状态。利用这一特性使H-FABP蛋白在PBV220系统中得到表达。在表达过程中我们进行了温度和时间的优化，在30℃增菌，42℃条件下诱导5小时得到高效表达。重组人心肌型脂肪酸结合蛋白的成功克隆与表达，为进一步研究心肌型脂肪酸结合蛋白在疾病的诊断和疗效判定中的意义奠定了基础。
文档编号C12N15/09GK101250517SQ200710056208
公开日2008年8月27日 申请日期2007年10月24日 优先权日2007年10月24日
发明者于源华, 巍 侯, 玥 侯, 张淑华, 许淑芬 申请人:侯 玥;许淑芬;侯 巍;于源华;张淑华