一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体设及一种快速定量检测屯、脏型脂肪酸结合蛋白的 均相巧光免疫试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 急性屯、肌梗死（AMI)的发病率及死亡率均很高，现代治疗学认为，AMI发病后能迅 速得到确诊并进行再灌注治疗，对于降低死亡率及改善预后十分重要。WK)推荐的Affl的诊 断条件为：临床症状、屯、电图异常和生化指标等。但大约1/3的Affl病人早期临床症状不典 型，约50%的病人屯、电图不能出现特征性ST段改变，所W在此期的诊断来说一个灵敏又有 特异性的屯、肌指标尤为重要。
[000引 屯、脏型脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid binding protein, H-FAB巧是一族 分子量为14-16kD的胞内蛋白质，至少有肝、小肠、屯、、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮 9种类型，各型之间具有不同的免疫学差别。H-FABP是存在于屯、肌细胞胞浆内的可溶性蛋 白质，分子量15kD，占屯、肌内蛋白含量的（4 + 8)%，由132个氨基酸构成，呈酸性（pI5)，参 与细胞脂肪酸的摄取、转运和代谢。屯、肌胞浆与血液中的比值为200000:1。在骨骼肌的浓 度不到屯、肌里的十分之一，在远端肾小管、脑组织的特殊部位、乳腺、胎盘内含量更低。而肌 红蛋白在骨骼肌的浓度是屯、肌里的两倍。正常条件下血流中几乎检测不到H-FABP，极微量 的H-FABP可能与破坏的骨骼肌持续释放H-FABP有关，在屯、肌细胞受损时，细胞膜完整性受 到破坏，H-FABP透过受损细胞膜进入外周血循环，使其血中H-FABP含量升高，1.化开始升 高、化达到高峰、2化降至正常。该一特性使得H-FABP成为检测屯、肌损伤早期生化标志物。 因与其它FABP在免疫学上具有特异性，不会发生交叉反应，故对屯、肌损伤的诊断特异性较 强。另外，H-FABP通过肾脏代谢，W原形排出，所W肾功能不全时血里H-FABP的浓度会升 局。
[0004] 目前研究已证实H-FABP对微小屯、肌损伤敏感，检测血浆H-FABP水平可作为反映 屯、肌不可逆损伤的生化标志物，与屯、肌损害的程度成正相关，此将为临床法医学对微小屯、 肌损伤及外伤性屯、肌梗死的判定及预后屯、功能的诊断提供一灵敏性客观指标，在临床法医 检案中有重要的应用价值。
[0005] 国外较常应用的有Rapicheck和CardioDetect两种定性检测试剂盒，10-15min内 得到结果。Latera^f low是一种准确度更高的定量检测方法，2003年用于临床，15min得到 结果。W上检验方法简易快捷，节约时间和费用，不需要特殊检测设备，值得临床推广。夹 屯、酶免法应用两个来源不同的抗人H-FABP的抗体，分别做固相和液相结合抗体，临床常用 有一步法和两步法。优点为检测结果准确，与骨骼肌蛋白、肌红蛋白、肌浆球蛋白、肌巧蛋白 无交叉反应、不需大型仪器，费用合理，缺点是用时较长，需时45-90min，不利于超早期AMI 的诊断及进一步处理。
[0006] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在时间分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技术的基础上形成的一种新的巧光免 疫分析技术。TRFIA技术采用的巧光物质与传统的巧光染料完全不同，采用的是铜系元素 館巧U)、得（Tb)等作为巧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存=年，因而成 为二十一世纪最热口的免疫分析技术。
[0007] 均相巧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记化和巧光染料 Alexa647。化标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm 巧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发巧光染料Alexa647发射出665nm 巧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在 665nm出可测得巧光信号。该种方法省却了酶联免疫法反复解育和洗板等烦琐操作步骤，几 分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境 等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647该对巧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300?500nm巧光，不能激发Alexa647发射 巧光信号650nm激发光。因此非特异性巧光非常低。
[000引本发明采用均相巧光免疫快速检测技术，利用巧光的高灵敏特点，同样也避免了 胶体金或者巧光H-FABP干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准确 度和重复性的不良影响。由于均相巧光免疫检测中样品与巧光标记抗体全过程都在液相中 全面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也增 加了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高了 定量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有H-FABP检测技术的不足，提供一种快速定量检测 H-FABP的均相巧光免疫试剂组。本发明根据巧光免疫技术特点和H-FABP抗原抗体系统特 点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试剂组检测H-FABP水平，具有简 单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于 临床快速检测。
[0010] 本发明的第一个方面是提供一种快速定量检测屯、脏型脂肪酸结合蛋白的均 相巧光免疫试剂组，包括稀±元素馨合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体 (anti-FABP)、近红外巧光化合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和系列浓度 的屯、脏型脂肪酸结合蛋白校准品。
[0011] 优选地，稀上元素馨合物为化馨合物。
[001引更优选地，稀±元素馨合物为BHHCT-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-对节基）-4-氯横酷基苯与館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0013] 优选地，所述近红外巧光化合物为Alexa系列近红外巧光化合物、DyLi曲t系列近 红外巧光化合物和CF系列近红外巧光化合物中的至少一种。
[0014] 更优选地，所述近红外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 种。
[0015] 优选地，所述系列浓度的屯、脏型脂肪酸结合蛋白校准品由校准品稀释液稀释屯、脏 型脂肪酸结合蛋白配制而成，所述校准品稀释液为含0. 01-0. 5wt%阳G800、l-5wt% BSA、 5-20wt%甘油、0. 01-0. 05wt%表面活性剂的MOPS缓冲液。
[0016] 屯、脏型脂肪酸结合蛋白校准品可用塑料瓶密封包装。
[0017] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的均相巧光免疫试剂组的制 备方法，包括W下步骤：
[0018] 1)稀±元素馨合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
[0019] 取0. 5-5mg/ml的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液，加入0. 05-0. 5mol/ L的Na肥〇3溶液后，调抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配体化合物溶液，揽拌反应 0.6-2h，分离得到配体化合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，加入终浓度为 0. 05-0. 5wt %的BSA和0. 01-lwt %的NaNs，调抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入化溶液， 使配体化合物与化等摩尔浓度，即得，其中，抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液、 NaHC〇3溶液和配体化合物溶液的体积比为0.1-1 : 1 : 0.01-0.05;
[0020] 2)近红外巧光化合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
[0021] 将抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀释至 0. 5-5mg/ml，加入近红外巧光化合物溶解液，揽匀，室温解育0. 5-化，分离得到近红外巧光 化合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；
[0022] 3)系列浓度的屯、脏型脂肪酸结合蛋白校准品的制备：
[0023] 将屯、脏型脂肪酸结合蛋白用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
[0024] 其中，1)、2)和3)的顺序可W任意颠倒。
[0025] 其中，稀±元素馨合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用于免疫分析 时，用标记物稀释液稀释使用，2-8°C分装保存。
[0026] 其中，近红外巧光化合物标记的抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用磯酸盐缓 冲液稀释，2-6 °C保存。
[0027] 其中，屯、脏型脂肪酸结合蛋白校准品2-6°C保存。
[002引优选地，抗屯、脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体在于配体化合物反应之前，先进行 透析处理。
[0029] 优选地，步骤1)中配体化合物为BHHCT或BHHBCB。
[0030] 优选地，步骤1)中分离得到配体化合物标记的anti-FABP通过离屯、和柱层析方式 进行。柱层析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脱。
[0031] 优选地，步骤2)中，分离得到近红外巧光化合物标记的anti-FABP通过柱层析的 方式进行。
[0032] 进一步优选地，步骤2)中，柱层析采用G25凝胶柱。
[003引优选地，步骤2)中，室温解育时，每隔10-20min混匀一次。
[0034] 本发明的均相巧光免疫试剂的使用；先将稀±元素馨合物标记的anti-FABP溶液 加入反应微孔中，再加入近红外巧光化合物标记的anti-FABP溶液，最后分别加入H-FABP 校准品和临床检测样品，37°C反应20分钟后，用均相巧光免疫分析仪检测判读结果。
[0035] 本发明提供的快速定量检测屯、脏型脂肪酸结合蛋白的均相巧光免疫试剂组，其反 应原理为双抗体夹屯、法的均相巧光免疫法。待测样品与适当比例的稀±元素（例如化 3+) 和巧光标记抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程中样品中的H-FABP既能专一 性地与稀±元素标记的抗H-FABP抗体充分结合，也能与巧光标记的H-FABP抗体充分反应， 形成"稀±元素-anti-FABP-FABP-anti-FABP-巧光化合物"免疫复合物，巧光强度可用 专