专利名称：具有杀虫活性的蛋白的制作方法
技术领域：
本申请涉及一般控制有害有机体，更具体地说，组成成分和方法，控制方法和白蜡 窄吉丁( ‘ ΑΒ的”)，Agrilus曲柳窄吉丁。
背景技术：
苏云金杆菌(“Bt基因”)是一个孢子形成，杆状，革兰氏阳性菌密切相关，蜡样芽 胞杆菌。大量的Bt基因已被发现并分离到亚种，分组，如苏云金芽孢杆菌苏云金杆菌，苏云 金芽孢杆菌kurstaki，苏云金芽孢杆菌aizawai的基础上，分类计划最初由博纳富瓦，并在 1963年开发德巴尔雅克等。转Bt显然是从其他杆菌区别在于细胞内晶体s，这是不溶性的 蛋白生产中的存款，其中许多人对各种昆虫物种的杀虫活性。在芽孢形成过程中，综合了大 量转Bt —个或几个蛋白S的然后晶体利泽成各种形状的。转Bt基因为基础的昆虫icides制定与孢子S和转Bt发酵过程中产生的材料， 但主要的活性成分S是这些昆虫icidal蛋白晶体S作为第已知哭毒素哭了一个天然毒素 毒性后，两者均致命剂量摄入通路涉及的易感主机1)由适当的PH值在中肠晶体毒素原增 溶作用的结果；2)酶切割的毒素原分子在特定地点的活化形式的结果该毒素；3)活化毒素 分子受体结合具体的刷状缘膜，导致肠上皮细胞裂解；4)不可弥补的损害编队在肠道中肠 细菌进入血腔造成的；及5)死亡败血症(Knowles和埃拉尔1992年，鲍尔和潘克拉茨1992 年)。该基因编码的转Bt晶体蛋白被称为“哭，因为它的晶体-表型的生产”。第一次哭 基因，后来被指定哭生长素，克隆约由施奈夫和怀特利(1981年，国立。Natl。ACAD的。科 技。美国78个，2893年至2897年)20年前。从那时起，额外的cry基因的克隆许多报告已 经出版。即使在一转Bt生产菌株的晶体蛋白在昆虫s品种特性不同。大多数转Bt晶体生 产线昆虫icidal蛋白的角度衡量，鳞翅目物种活跃。此外，还有转Bt菌株产生晶体线昆虫 icidal蛋白活火山对双翅目和鞘翅目昆虫物种。截至1997年，约190Bt基因为基础的微生物昆虫icides登记在美国的某些鳞翅 目，双翅目控制和鞘翅目害虫fl (施奈夫等。1993年)。由于蛋白秒，转Bt的哭声基因用于 赋予昆虫抗性植物和微生物秒使用基因工程在转Bt晶体蛋白，Cry3，Cry7，Cry8，Cry9和Cry43已知的对鞘翅目物种活跃。 其中，CrySCa报道，对付圣甲虫甲虫活跃(大场等。，1992年，j的耳目一新。微生物。14， 54-57)。在2003年，浅野等人。(2003年，生物防治28 (2003)，191-196)公布了一个新的转Bt菌株称为SDS502这显示了对鲳cuprea，甲侧柏，和非常高的水平弧丽金龟活动调查粳 稻，这是圣甲虫甲虫物种。体育粳稻，日本甲虫，是在美国特别重要的基因高山口 SDS502粳 稻活动负责已被隔离并命名crySDa。该基因编码的蛋白，CrySDa，发现有一高，对日本甲虫 的具体活动，至少高一倍作为CrySCa和Cry43Aa，另外两个转Bt晶体蛋白S与具体活动对 日本甲虫和其他金龟子杀虫活性。进一步资料SDS502，CrySDa，并CrySDa可能会发现在美 国专利号6962977'，发出2005年11月8日，这是此纳入参考的全部。在昆虫害虫的，任何已知的杀虫活性哭了先前发现，白蜡窄吉丁(EAB的)，花曲柳 窄吉丁(鞘翅目吉丁科)，可能是其中最具破坏性的。在白蜡窄吉丁是蛀木虫，原产于中 国，日本，韩国，蒙古，俄罗斯远东地区，以及台湾(于1992年)。成虫从树上开始出现在5月底，在6月的高峰出现。在白蜡树叶完全刷新了这个 时候。EAB的成虫比较长寿命(在实验室2个月)和灰树木的树叶在其整个生命。他们的 日子大多是在花的檐篷，并要求饲养3周前的成熟开始产卵。有一些交错出现，因为EAB的 发展在一或两年，这取决于对虫害的下降阶段，由于灰卫生早在侵扰他们需要2年时间攻 击分行上层林冠削弱树。一旦冠下降是广泛的，他们攻击的主要干道和发展，是在一年内完 成。2002年，被确定为EAB的广泛灰(白蜡属的原因。)在密歇根州和东南部附近的 安大略省，加拿大死亡率。EAB的已造成约自其在北美(抵达Cappaert等2500万下密歇根 州白蜡树。2005年，波兰和麦卡洛2006年)。EAB的也蔓延到美国密歇根州上半岛，俄亥 俄，印第安纳州，马里兰州，弗吉尼亚州和伊利诺伊州。尽管州政府和联邦政府旨在遏制EAB的，缺乏有效的方法来检测EAB的遍布树木 和虫害面积隔离导致了监管机构从一个贫穷战略转变为管理1。在美国，EAB的根除努力涉 及所有在周围白蜡树(美国农业部动植物检疫局2006年)著名虫害的Vi英里区搬迁。到 被发现的感染和治疗时间，然而，EAB的了通常已经消灭这些外区分散。青铜桦木镗床，甲anxius，美国一个天然的EAB的相对已知传播在10至20英里 的速度，每一年，这已被视为一个EAB的'自然扩散率(估计2003年提出的联邦登记册)。 EAB的飞行和分散的格局最近的研究发现孕女性强制移民；一飞一女交配2公里，每天平均 在4天飞行近10公里(泰勒等人。2006年)。除了自然扩散，蔓延的EAB的是加速通过人 类辅助布满灰的木柴，木材，实木包装材料的运动，和苗木。这导致了 EAB的蔓延从密歇根 州的马里兰州和弗吉尼亚州在2003年；检疫遵守和执行仍然是一个问题。由于EAB的整个 北美，管理机构，土地管理者和公众传播正在寻求诸如微生物和生物控制的可持续管理工 具，以减少EAB的人口密度，减缓其传播(Cappaert等人。2005年，高2006年的报告，波兰 和麦卡洛2006年，BenDor等。2006年)。EAB的带来的风险，在北美灰资源是巨大的。对粉煤灰的60种，白蜡属。全世界已 知的16种天然到北美洲(哈克等人。2002年)。灰种北美特有的森林和已知的易受EAB 的包括白色灰(楼美洲)，绿灰(楼permsylvanica)，灰，黑(黑楼)树，是森林的重要组 成部分；布卢阿什(楼quadrangulata)和南瓜灰(陈大良号)，这是不太常见的物种。有 越来越多的证据表明，EAB的攻击都将白蜡属。，虽然先天易感性的物种和品种而异(刘等 人。2003年)，魏等人。2004年，Rebek等。2005年，刘等人。印刷中)。每个白蜡属。适应是在森林生态系统略有不同的栖息地。几个品种的不良的场所和潮湿的土壤排水宽容，保护环境敏感的沿岸地区；如灰黑色的纯林生长在沼泽和沼泽中， 他们提供浏览，热盖北部地区，保护野生动物，如鹿和驼鹿。在农业和防护林区，为牲畜提供 了至关重要的灰住房；例如约25年的北达科他州所有的树木％是白蜡属。年轻的白蜡树 的树皮，包括海狸，兔哺乳动物青睐食品，和豪猪；老树木提供诸如木材鸭，啄木鸟，山雀腔 筑巢鸟类的栖息地，和红胸币鸟；种子消耗鸭，歌曲和游戏鸟类，小型哺乳动物和昆虫第根 据最近美国农业部森林服务清单，有约80亿美元，其中美国的林地约6. 93亿美元在密歇根 州发生(美国农业部2006年财政司司长)白蜡树。截至2006年，经理们估计25密歇根 白蜡树万元屈服于EAB的。作者EAB的对林区生态环境的影响是难以量化或预测，虽然一 2. 6%的林地平均有白蜡树属植物。(美国农业部财政司司长2006年)。阿什木材价值为需要强大的硬木材的应用，但刚性不足枫木。在美国东部，一个 114亿元的净灰板英尺锯木材采伐量，包括7. 5的所有阔叶树种量％。由不同国家的影响， 但仅在密歇根州的木材灰估计为770亿板英尺收获一次。2001年，灰分超过1. 49亿美元在 美国白蜡生产的木材产品板英尺占主要商业硬木是在生产中使用的工具手柄，球棒，家具， 地板，集装箱，汽车和铁路联系，划艇桨，雪鞋，船，门，柜，是为灰绿色，如申请使用实木板条 箱，盒，把手，并在生产高档纸纤维，黑色灰通常用于室内家具，橱柜，和天然的美国人需要 为竹编艺术这一物种。除了制造业，白蜡树参与了城市景观，由于其历史抵抗害虫和不利的生长条件，如 土壤板结和干旱，容忍了重要作用。许多灰树，现在街头，树荫服务和景观树木种植，以取代 荷兰榆树病摧毁榆树，白蜡树现在包括5-20在整个北Ameri约所有街道树木％在美国，城 市地区覆盖约3. 5%的土地总面积，包含超过75%的人口，支持约38亿美元的树木。美国 芝加哥市约603，000，提供叶面积的14. 4(2003年联邦登记册)％白蜡树。树被认为是至关 重要的，因为他们对城市的卫生隔离气态空气污染物及微粒物质，帮助人们透过树荫下保 护他们提供能量，协助雨水分散，为城市群防护林带，并有助于审美快感生活的城市，居民 和游客。阿什显然是城市森林的重要组成部分为经济和环境的潜在影响，如果这种木材无聊害虫的人，成为在美国成立，是广泛 的。作者在美国的7553万增长林地补偿价值白蜡树估计二千八百二十二亿五千万美元。现正研究开发EAB的管理工具，使用常规昆虫icides，然而，这些化合物大致毒 性，价格昂贵，最有效的昆虫icides要求持牌施药处理，使他们在公园的使用，林地，森林， 湿地和沿岸地区经济和环境不可接受(鲍尔等人。2005年)。对森林昆虫控制的主要管理 工具登记微生物昆虫与昆虫病原细菌苏云金杆菌(Bt)的制定icides。公共飞播套用的转 Bt基因为基础的微生物昆虫icides接受，主要用于在美国的吉普赛蛾的控制，是高，因为 Bt基因是有效的，自然发生的，相对的主机具体的，可生物降解，生物控制，如兼容其他管理 策略，并保留后，整个世界(麦卡洛和鲍尔2000年，西格尔2000)使用20年良好的安全记 录。林业是其中的微生物昆虫icides已取代常规昆虫icides几个市场之一。这产生 于对昆虫害虫舞毒蛾等森林管理Bt基因为基础的昆虫icides发展和云杉在60年代和70 年代青虫。在20世纪80年代和90年代，包括发现和苏云金芽孢杆菌亚种的商业化技术发 展。kurstaki高清我(Btk制剂)，高效力的产品改进配方的稀释在超低量空中喷洒，和广 泛的业务经验，导致在两落叶针叶林的管理和使用效益及环保标准昆虫icides森林食叶类群昆虫整个世界。1990年至1998年，Btk制剂应用于约四百五十〇万英亩(180万公顷) 的落叶昆虫第林地管理后EAB的2002年发现，网络实名制注册评估了 4个转Bt对鳞翅目昆虫的控制方 法icides活动和/或对鞘翅目害虫白蜡窄吉丁成虫fi。这些产品对EAB的证明无效，支持进 一步研究需要确定一个EAB的积极转Bt菌株(鲍尔等人。2005年)。这涉及到一些克隆 毒素及约30鞘翅目欧米茄积极转Bt菌株从美的文化和收藏品获得专利正在进行的EAB的 成虫和幼虫生物测定。发明概述本公开包括能够产生毒性蛋白的微生物苏云金杆菌血清变型蜡螟SDS502菌株， 所述毒性蛋白可以起到有害有机体控制剂的活性成分的作用，其对于白蜡窄吉丁(EAB)、花 曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)具有高特异性杀虫活性。本公开还证实衍生自SDS502菌株的下列材料都对EAB具有活性毒素原和毒素形 式的CrySDa纯化蛋白、CrySDa晶体毒素和孢子混合物、和衍生自SDS502菌株的发酵液的 发酵材料。本公开的另外的实施方案证实，当和分离自黄粉虫(鞘翅目拟步甲科)的钙 黏着蛋白样蛋白混合时，SDS502材料对于昆虫害虫(包括EAB)的增强的杀虫活性。该 肽rTmCadlp由来自黄粉虫的一部分Cry3Aa毒素粘结钙黏着蛋白(TmCadl)制成，当其和 SDS502材料混合时，增加EAB的死亡率。本公开的另外的实施方案证实了液滴吸收生物测定法，其被开发以测定各种材料 针对成年EAB的活性。附图简要说明
图1示出液滴吸收生物测定，其被开发以测定衍生自SDS502的各种材料对于成年 EAB的活性。图2示出当两种形式的蛋白在SDS-PAGE凝胶上运行时，Cry8Da毒素原和Cry8Da 活化毒素之间的分子量差别。毒素原形式的蛋白的分子量为135KDa，而活化形式为约 65KDa。图3示出CrySDa毒素原和CrySDa活化毒素对于成年EAB的生物测定结果，它们 溶于50mM NaPO4缓冲液(pH 8. 0)中，这证实0. 04至0. 10 μ g Cry毒素的96_h中间致死剂 量(LD50)具有相对高的毒性。毒素原和活化毒素的类似毒性表示EAB中肠酶能够活化该 毒素。变性CrySDa毒素对于接受2. 5 μ g毒素剂量的EAB成虫没有毒性，所述毒素通过在 50mM CAPS缓冲液(pH 10)中煮沸20分钟而变性，而所有EAB成虫在接受类似剂量的非变 性Cry8Da毒素72h内死亡。这证实在我们的生物测定中EAB成虫死亡率由SDS502 Cry8Da 蛋白引起，其是首先证实对于EAB具有毒性的Cry毒素。评价CrySDa对于EAB幼虫的毒性 的生物测定同样证实对于幼年形式的EAB的杀虫活性。图4示出SDS502孢子和晶体的混合物。白色箭头指向包含CrySDa毒素的晶。更 大的椭圆形目标为孢子。图5示出针对成年EAB测试时，多种孢子_蛋白毒素晶体混合物的死亡率％，包括 15种不同菌株的Bt和它们的相对毒性对成年EAB至SDS502孢子-晶体混合物。Bt培养 物在DSMG培养基中在振荡水浴培养下生长，晶体/孢子以27，OOOg旋转，并使用无菌DiH20和NaCl在20，OOOg下洗涤，重悬于无菌DiH20中，超声，稀释液负载到SDSPAGE上，并且使 用凝胶Doc利用比重计测定的蛋白浓度和作为标准曲线的BSA相关联。图6示出SDS502天然孢子-晶体混合物对于成年EAB的中间致死剂量(LD50)。 甚至成年菌落的雄心和雌性EAB成虫都单独给予0. 5 μ L的SDS502晶体/孢子复合物液 滴，其是使用已知浓度的CrySDa毒素冻干的粉末。该粉末混悬于DiH20中，并将该混悬液 无菌稀释以制备剂量为0. 03125,0. 0625,0. 125,0. 25和0. 5 μ g Cry毒素，使用DiH20作为 对照。对于6个处理/生物测定，十五个EAB被单独给药，重复两次生物测定，用SAS Proc Probit 分析。图7示出在给予各种浓度的SDS502天然孢子-晶体混合物后的天数内，成年EAB
累积死亡率％。图8示出将白蜡树叶浸渍到混悬于Silwet中的SDS502原粉中后，在叶浸渍测定 中的成年EAB死亡率％。图9示出当混合或不混合钙黏着蛋白样蛋白时，纯化CrySDa毒素对于成年EAB的 相对毒性的生物测定结果，肽rTmCadlp由分离自黄粉虫(鞘翅目拟步甲科)的一部分钙 黏着蛋白TmCadl制成。
图10示出由来自T. molitorCTmCadl)的一部分Cry3Aa毒素粘结钙黏着蛋白制 成的肽rTmCadlp，其包括预测的毒素粘结区域。TmCadl肽片段对应于全长蛋白(核苷酸 4，076-4，661的翻译)的氨基酸残基1，322-1，516。黑体和下划线表示TmCadl氨基酸(195 个残基)，而氨基酸末端处的37个残基来自pETl 51-D-T0P0载体，包括组氨酸标签、V5抗 原决定部位标签和TEV蛋白酶切割位点。该肽在体外E. coli中表达并且纯化以用于生物 测定。
图11示出生物测定装置，其用于暴露于白蜡树叶上的BtSDS502制剂的EAB成虫。 箭头表示SDS502制剂的干燥液滴。
图12是示出在暴露于使用SDS502制剂液滴的白蜡树叶的过程中EAB成虫的累积 死亡率％的图。序列表简要说明SEQ ID NO 1 示出衍生自 SDS502 菌的 Cry8Da 蛋白。SEQ ID NO :2 示出 rTmCadlp 肽，其由来自 T. molitor (TmCadl)的一部分 Cry3 Aa 毒素粘结钙黏着蛋白制成。SEQ ID NO 3示出一部分rTmCadlp肽，其对应于T. molitor的全长TmCadl蛋白 的TmCadl氨基酸残基1，322-1，516。发明详述综述CrySDa蛋白的筛选证实对于白蜡窄吉丁(EAB)，花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科) 具有活性。这种高活性对EAB的具体体现在实验室生物测定的EAB的S与成人和幼虫都 Cry8Da毒素原和Cry8Da活化毒素，并与一对Cry8Da晶体和孢子组成的混合材料。这证实 了我们的生物测定s EAB的死亡率是由SDS502 Cry8Da蛋白引起的。本公开提供了一个微生物苏云金杆菌血清变型蜡螟SDS502菌株从该生物成分来自，以及SDS502菌株本身，具有杀虫对白蜡窄吉丁活性(EAB的)，花曲柳窄吉丁(鞘翅目 吉丁科)。SDS502菌株有能力产生一个蛋白是毒性为EAB的幼虫和成虫，并可以作为一个 EAB的控制剂在一个菌株的SDS502是通过对各种化学物质数量制定发酵形成活性成分是 否作为地面或空中喷洒或作为地面应用颗粒可湿性粉剂或液体。生物成分具有本毒性活性是Cry8Da蛋白具有杀虫活性的菌株，或下列之一 1蛋 白的氨基酸序列有从CrySDa蛋白氨基酸序列产生索取此外，删除或替代的一 S和多元化的 氨基酸有类似杀虫活性，在DNA编码CrySDa蛋白具有杀虫活性，包括合成DNA或基因，与 DNA,与一个氨基酸序列蛋白有95 %，90 %，85 —个微生物转化％，80 %或75 %的序列同源 性的序列如SEQ ID号1，具有杀虫活性。另外，本公开介绍了一种添加剂，当混在SDS502菌株及其杀虫蛋白，控制的有害 有机体对EAB的SDS502菌株特点是增加了。这个添加剂是钙黏着蛋白样蛋白分离黄粉虫 (鞘翅目拟步甲科)。在另外的实施方案中，添加剂可能是蛋白或肽有95%，90%，85%， 80%或75%序列同源性为如SEQ肽ID号2或的SEQ ID号3。B.通常技术对本公开实践的方法通常会使用，除非另有说明，常规的分子生物学，微生物学， 细胞生物学，生物化学技术，免疫学，这属于是最先进的技术。这种技术完全解释文献中，例 如，在细胞生物学一个实验室笔记本，在分子生物学(当前的协议调频奥苏贝尔等人。合 编，1987)，在分子短议定书生物学(Wiley和Sons，1999)。此外，程序采用的商用检测试剂 盒和试剂将按照通常被用来制造商定义的协议，除非另有说明。C.定义术语“原粉”在这里描述的物质从SDS502菌株的发酵液后的处理(如喷雾干燥或 冷冻干燥开始培养发酵液产生的)来产生干原粉。该粉末包含SDS502有机体、其晶体毒素 和孢子。术语“EAB控制剂”或“有害有机体控制剂”用于描述SDS502基原粉的制剂，其可 应用于各种应用程序通过的方法，各种不同的环境与控制EAB的目的数目。例如，试剂可以 是地面或空中喷洒液体或可湿性粉剂，或可为地面应用颗粒。术语“基因”泛指任何具有生物功能相关的DNA片段。基因包括编码序列和/或所 需的表达以及序列是否允许在对本公开的其中两个基因的序列是通过一个连接器融合，生 产出更复杂的一个新的基因组合功能的方法，个案调控序列生物学功能。基因还包括非表 达的DNA片段对基因表达的这一需要，如其他蛋白序列识别多种功能。基因可从多种来源， 包括从克隆的利益来源，例如任何生物体，或已知或预测的综合序列信息，并可能包括旨在 人工序列具有理想特性。术语“同源性”或“同源百分比”在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，是 指两个或两个以上的序列或子序列是相同的。两个序列是“基本上同源的”如果两个序列 有一个氨基酸残基或核苷酸，它们是相同的(即60 %的身份，可任选地65 %，70 %，75 %， 80%，85%，90%，95%或99%的身份在指定区域，或者没有指定时，在整个序列)，相比，最 大程度地排列在一个比较对应的窗口，或指定的区域作为测量使用下列其中一个序列比较 算法或手工调整和视觉检查。可任选地，身份存在过一个约50核苷酸(或10个氨基酸)的长度，或在一个区域是100至500或1000或以上的核苷酸(或最好是至少20，50，200或
更多区域的氨基酸)的长度。对于序列比较，通常一个序列作为一个参考序列，对此测试序列进行了比较。当使 用一个序列比较算法，测试和参考序列为输入电脑，指定坐标序列，如果必要，序列算法程 序参数指定。默认程序的参数可以使用，或替代参数可以指定。序列比较算法，然后计算为 百分之测试序列特征序列相对于参考序列的基础上程序参数。本文中使用的“比较窗口，，包括提述的任何职位，包括连续的一个部分，但不限于 从20到600，通常大约在200至50，更通常大约在100至150这可能是一个序列后比较两个 序列的相邻位置的相同数目的最佳参考序列一致。序列比对的方法进行比较是众所周知的 艺术。最优序列比对可以进行比较，例如通过Smith和Waterman的局部边缘算法(1970) Adv. Appl. Math. 2 :482c ；Needleman 和 Wunsch 的均勻算法.MoL Biol. 48 :443，1970 ；寻找 类似性的方法，Pearson 和 Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. ScL USA 85 :2444，1988 ；这些算法 的计算机补充(GAP，BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI)、或手工算法禾口 肉目艮 观察(例如参见 Brent et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.，2003))。两种算法是决定百分之序列同源性和相似性序列合适的例子是2. 0高炉和BLAST 算法，这在下列文献中有所描述Altschul et al.，Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402，1977 ； 和Altschul et al.，J. MoL Biol. 215 :403_410，1990。为履行高炉分析软件可通过公开 的国家生物技术信息中心。该算法，首先是确定，确定在查询序列，或者符合或满足了一些 积极的值阈值评分时，对同一数据库中的序列长度字对齐的话短长的T W高得分序列对 (HSP)的。T是被称为阈值附近评分(Altschul et al. , supra)。这些初步的邻里字点击 发起搜索，发现热休克蛋白含有这些不再作为种子的行为。这个词的点击率是每一个序列 扩展到沿两个方向为尽可能的累积得分排列可以增加。累积分数计算，为核苷酸序列，参 数m(—对匹配的残留奖励分；总是>0)和N(错配罚分，此外，残留；快捷联系人0)。对于 氨基酸序列秒，计分矩阵，用来计算累积得分。这个词在各个方向延伸命中是停止时对齐 的累积得分下降的数量X从关闭它的最大价值实现；的累积得分去零或以下，由于一个或 多个负累积得分残留路线；或任一序列的结尾为止。该BLAST算法参数w，睾酮，和X确定 的灵敏度和定位速度。该方案的核苷酸序列BLASTN程序()使用的默认11字长(宽)，期 望(E)或10，女=5，氮=-4和1两个股比较。对于氨基酸序列时，经BLASTp方案默认使 用了 3字长，并期望10(E)和计分矩阵的BL0SUM62(参见Henikoff and Henikoff，Proc. Natl. Acad. ScL USA 89 10915,1989)alignments(B)of 50,expectation (E) of 10, M = 5, N = -4，并且两股进行比较。该BLAST算法也进行了相似的两个序列的统计分析(例如参见，Karlin and Altschul,Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :5873_5787，1993)。一个由 BLAST算法提供了相似 的措施是最小的总和概率(P(N)的)，它提供了一个的概率，其中一两个核苷酸或者氨基酸 序列s匹配会出现偶然的迹象。例如，核酸被认为类似于一个参考序列，如果在一个测试对 比总结概率最小的参考核酸核酸是小于0. 2，更低于约0. 01最好，最好小于约0. 001。D.方法和应用
本公开涉及具有EAB杀虫活性的蛋白、编码蛋白的DNA、EAB控制剂和控制方法、以 及能够产生毒性蛋白的微生物苏云金杆菌血清变型蜡螟SDS502菌株，所述毒性蛋白可以 起到EAB-控制剂的活性成分的作用。使用衍生自SDS502的数种不同的毒性蛋白材料，本公开证实SDS502 Cry8Da蛋白 针对EAB成虫和幼虫具有杀虫活性。在另一发面，本公开提供增强杀虫活性的方法，该方法包括通过加入肽rTmCadlp， 增强SDS502的针对EAB幼虫和成虫的特定毒性活性和活度。提供下列实施例来表明本公开的方法可用于产生SDS502基控制剂，所述控制剂 可用于控制白蜡窄吉丁(EAB)、花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)。可向SDS502基控制剂中 加入钙黏着蛋白样蛋白来增强所述控制剂控制昆虫的由所述控制剂对准的效果。本领域技术人员将认识到尽管描述和说明了特定实施方案，但它们并非旨在限制 本文中公开的发明。
实施例实施例1 :Cry8Da蛋白对EAB成虫和幼虫是毒性的Cry8Da毒素原和Cry8Da活化毒素对于成年EAB的生物测定结果，它们溶于50mM NaPO4缓冲液(pH 8. 0)中，这证实0. 04至0. 10 μ gCry毒素的96_h LD50具有相对高的毒 性。毒素原和活化毒素的类似毒性表示EAB中肠酶能够活化该毒素。变性CrySDa毒素对 于接受2. 5 μ g毒素剂量的EAB成虫没有毒性，所述毒素通过在50mM CAPS缓冲液(pH 10) 中煮沸20分钟而变性，而所有EAB成虫在接受类似剂量的非变性CrySDa毒素72h内死亡。 这证实在我们的生物测定中EAB成虫死亡率由SDS502 CrySDa蛋白引起，其是首先证实对 于EAB具有毒性的Cry毒素。评价CrySDa对于EAB幼虫的毒性的生物测定同样证实对于 幼年形式的EAB的杀虫活性。实施例2 :Cry8Da蛋白晶体-孢子混合物对于EAB成虫和幼虫是毒性的除了纯化形式的CrySDa蛋白，也测试了天然形式的该蛋白针对EAB成虫和幼虫的 活性。Bt培养物在DSMG培养基中在振荡水浴培养下生长，晶体/孢子以27，OOOg旋转， 并使用无菌DiH20和NaCl在20，OOOg下洗涤，重悬于无菌DiH20中，超声，稀释液负载到SDS PAGE上，并且使用凝胶Doc利用比重计测定的蛋白浓度和作为标准曲线的BSA相关联。简言之，甚至成年菌落的雄心和雌性EAB成虫都单独给予0. 5 μ L的SDS502晶体 /孢子复合物液滴，其是使用已知浓度的CrySDa毒素冻干的粉末。该粉末混悬于DW中，并 将该混悬液无菌稀释以制备剂量为0. 03125,0. 0625,0. 125,0. 25和0. 5 μ g Cry毒素，使用 Dff作为对照。我们对于6个处理/生物测定，十五个EAB被单独给药，重复两次生物测定， 用 SAS Proc Probit 分析。实施例3 :SDS502原粉对于EAB成虫和幼虫是毒性的我们证实白蜡树叶浸渍到混悬于Silwet中的SDS502原粉中后，在叶浸渍测定中 的成年EAB死亡率。SDS502菌株在这样的培养基中培养，其中细菌可通过常规发酵技术来生长。在5 升SDS502的发酵液中使用下列培养基来制备原粉
Glucose Fed-Batch 型发酵液4% (40g/L)脱脂大豆面粉lg/L NH4Cl1. 5g/L KH2PO43. 5g/L K2HPO40. 5g/L MgS047H20lOmg/L FeSO4 7H20lOmg/L MnSO4 H2O pH 用 KOH 或 H2SO4 调节至 7. O使用葡萄糖加料运行加料批次(加料速度0. 0125%的培养基体积/hr (0. 125g/ L/hr))，从3hr至16hr。在发酵后，离心固体材料并喷雾干燥。然后测试材料。和使用SDS502菌株SDS502菌株-产生的晶体蛋白作为单一活性成分的情况相 反，也可以将其混合除草剂、各种杀虫剂、细菌和植物生长调节剂，它们对于其他有害有机 体是有效的，协同多种效果，引诱剂，以及植物营养剂，肥料等，这旨在获得其他功能。实施例4 向CrySDa蛋白中加入钙黏着蛋白样蛋白增强对于EAB成虫和幼虫的毒 性一种增强杀虫活性的方法，包括证实通过加入蛋白-钙黏着蛋白样蛋白，SDS502 针对EAB幼虫和成虫的特定毒性活性。由来自T. Hi0Iitor(TmCadl)的一部分Cry3Aa毒素 粘结钙黏着蛋白制成的肽rTmCadlp，其包括预测的毒素粘结区域。TmCadl肽片段对应于 全长蛋白(核苷酸4，076-4，661的翻译)的氨基酸残基1，322-1，516。黑体和下划线表示 TmCadl氨基酸(195个残基)，而氨基酸末端处的37个残基来自pETl 51-D-T0P0载体，包 括组氨酸标签、V5抗原决定部位标签和TEV蛋白酶切割位点。该肽在体外E. coli中表达 并且纯化以用于生物测定。
图10示出rTmCadlp肽的序列。使用液滴吸收方法，甚至成年菌落的EAB成虫都给予纯化的CrySDa毒素，它们 溶于磷酸盐缓冲液中并进行下列处理1) Cry8Da毒素，2) Cry8Da毒素and rTmCadl，3) rTmCadl, or 4)缓冲液对照。以恒定的Cry8Da剂量，rTmCadl增强CryDa毒素在EAB成虫 中的毒性。这些结果(图9)支持可以使用该肽来改善来自SDS502的CrySDa的毒性，以用 于控制EAB。实施例5 配制的SDS502原粉对于EAB成虫是毒性的，并且通过白蜡树叶的EAB成 虫来抑制进食，所述白蜡树叶已经用SDS502制剂(组合物)处理Bt生物杀虫剂通常通过下列方式制备喷雾干燥或冻干形成孢子的Bt培养物 (称为Bt原粉或工业级活性成分(〃 TGAI “))，使用喷雾助剂(延展剂、粘结剂、UV保护 剂)来配制，并加入刺激剂。配制的Bt喷雾施用并沉积为叶表面上的非常小的液滴，喷雾 液滴的尺寸和数量已知影响Bt喷雾的毒性，其必须被吃掉以引起死亡。为了进行评价，必 须配制SDS502原粉。然而由于在昆虫中肠中的毒性作用，必须消耗Cry毒素，在消化后迅 速发生停止进食，因此通常向制剂中加入进食刺激剂。对于白蜡树叶的液滴吸收我们制备了 Bt SDS502制剂以测试由SDS502天然晶体和孢子构成的情况，其混悬在10%蔗糖溶液中。蔗糖用于改善Bt粉末和叶的粘附(“增粘 剂")并克服Bt进食抑制(“进食刺激剂")。为了评价SDS502制剂的效果，0. 02 μ L的材料液滴按照下列方式施加十滴以不同图案施加至Ι-cm2的白蜡树叶(沿着叶的边、沿着中间、分散)。每滴含约0.3yg CrySDa 毒素，30个测量的液滴的平均直径为819 μ m(
图11)。EAB成虫单独暴露于处理或对照(只 有蔗糖而没有TGAI)的叶96h，并且监控每日死亡率。如果消耗，叶用未处理的页来代替。
对照EAB成虫消耗约90至> 100 %的l_cm2的叶，而Bt-处理的EA成虫消耗约 < 5至60%的叶。在24h小时后，约15%的EAB死亡，在48h后60至80%的EAB死亡，到 96h，> 90%的成虫(在Bt处理的叶上进食)死亡，12%的对照死亡(
图12)。当沿着叶的 边、沿着中间、或分散暴露时，EAB成虫的死亡率响应类似。每个叶(从0至10)观察到消 耗平均2. 2个液滴，这暗示甲虫消耗平均0. 66 μ g，这几乎是EAB中该Bt SDS502的LD50的 三倍。
权利要求
1.一种控制花曲柳窄吉丁(Agrilus planipennis Fairmaire)的方法，该方法包括使用对于花曲柳窄吉丁具有杀虫活性的组合物处理植物；其中所述组合物包含苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白。
2.权利要求1所述的方法，其中所述苏云金杆菌蛋白包含和SEQID NO :1具有至少 85 %的序列同源性的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的方法，其中所述苏云金杆菌蛋白包含和SEQID NO :1具有至少 95 %的序列同源性的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的方法，其中所述苏云金杆菌蛋白包含SEQIDN0:1的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含黄粉虫(TenebriomoIitor)肽。
6.权利要求5所述的方法，其中所述黄粉虫肽包含和SEQIDNO :3具有至少85%的序 列同源性的氨基酸序列。
7.权利要求6所述的方法，其中所述黄粉虫肽包含和SEQIDNO :3具有至少95%的序 列同源性的氨基酸序列。
8.权利要求7所述的方法，其中所述黄粉虫肽包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
9.权利要求2所述的方法，其中所述植物是白蜡树属种(genusFraxinus) 0
10.权利要求9所述的方法，其中所述白蜡树属种的植物选自F.Americana, F.pennsylvanica、F.nigra 禾口 F. profunda。
11.权利要求2所述的方法，其中所述植物滋生花曲柳窄吉丁。
12.权利要求1所述的方法，其中所述组合物选自液体组合物、粉末组合物和颗粒组 合物。
13.权利要求1所述的方法，其中所述组合物对于花曲柳窄吉丁幼虫具有杀虫活性。
14.权利要求1所述的方法，其中所述组合物对于花曲柳窄吉丁成虫具有杀虫活性。
15.一种控制花曲柳窄吉丁的方法，该方法包括将对于花曲柳窄吉丁具有杀虫活性的组合物施用至花曲柳窄吉丁；其中所述组合物包含苏云金杆菌蛋白。
16.权利要求15所述的方法，其中所述组合物是口服的。
17.权利要求15所述的方法，其中所述组合物还包含黄粉虫肽。
18.权利要求17所述的方法，其中所述苏云金杆菌蛋白包含SEQID N0:1的氨基酸序 列，并且所述黄粉虫肽包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
19.一种控制有害有机体的组合物，包含苏云金杆菌蛋白；和黄粉虫肽。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述苏云金杆菌蛋白包含和SEQID NO=I具有至 少85%的序列同源性的氨基酸序列。
21.权利要求20所述的组合物，其中所述苏云金杆菌蛋白包含和SEQID N0:1具有至 少95%的序列同源性的氨基酸序列。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述苏云金杆菌蛋白包含SEQID NO :1的氨基酸 序列。
23.权利要求19所述的组合物，其中所述黄粉虫肽包含和SEQIDNO :3具有至少85%的序列同源性的氨基酸序列。
24.权利要求23所述的组合物，其中所述黄粉虫肽包含和SEQIDNO :3具有至少95% 的序列同源性的氨基酸序列。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述黄粉虫肽包含SEQIDNO :3的氨基酸序列。
26.权利要求19所述的组合物，其中所述组合物对于花曲柳窄吉丁具有杀虫活性。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述组合物对于花曲柳窄吉丁幼虫具有杀虫活性。
28.权利要求26所述的组合物，其中所述组合物对于花曲柳窄吉丁成虫具有杀虫活性。
29.权利要求19所述的组合物，其中所述组合物选自液体组合物、粉末组合物和颗粒 组合物。
全文摘要
本发明公开的有害有机体控制剂对于针对常规苏云金杆菌(Bt)杀虫剂获得耐药性的害虫是有效的，并且对于鞘翅目害虫、特别是白蜡窄吉丁(EAB)、花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)是有活性的。此外，本发明公开了能够产生毒性蛋白(Cry8Da)的微生物苏云金杆菌血清变型蜡螟SDS502菌株，所述毒性蛋白(Cry8Da)可以起到有害有机体控制剂的活性成分的作用以控制EAB。
文档编号A01N25/12GK102006881SQ200880126885
公开日2011年4月6日 申请日期2008年12月10日 优先权日2007年12月11日
发明者J·L·利比斯, L·S·博尔 申请人:美国农业部, 菲龙有限责任公司