包含结合Fc受体的多肽和抗原性多肽的用于介导免疫应答的融合蛋白的制作方法

专利名称：：包含结合Fc受体的多肽和抗原性多肽的用于介导免疫应答的融合蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明提供了用于在宿主内调节免疫应答的免疫结合物(immunoconjugate)。更明确地，提供了包括结合Fc受体的多肽(其结合Fc受体)的融合蛋白，所述融合蛋白引起Fc受体和相关结合的融合蛋白的内陷(internalisation)。所述融合蛋白在用于治疗和预防由病原微生物(尤其是病毒病原体)引起的感染的方法中有特殊效用。
背景技术：
：获得性免疫应答通过两种互补机制介导，包括可溶性分子尤其是免疫球蛋白的体液免疫，以及包括淋巴细胞尤其是T细胞的细胞免疫。免疫球蛋白的Fc结构域已显示具有效应子功能，所述功能主要是补体结合和Fc受体(FcR)结合。Fc受体结合到免疫球蛋白的恒定区，并且已定义的许多受体#3人为介导辅助功能，包括调理作用(opsonisation)和ADCC(Daeron1997,M.AnnualReviewImmunology,15;203-234"Ravetch和Clynes,AnnualReviewofImmunology.1998.16:421-432)。当结合不同的Fc受体时能介导不同的下游信号传导。更具体地，当结合一些Fc受体时显示激活免疫应答，而结合其他Fc受体时抑制免疫应答。因此FcR已显示激活或抑制免疫应答，这取决于它们的胞质区中存在的激活(ITAM)或承卩制(ITIM)基序(Daeron,M.AnnualReviewImmunology,15;203-234.1997)。先前的专利通过靶向抗原激活FcR的方式来寻求激活免疫应答，所述方式通过使用含有抗FcR抗体的双功能试剂实现(参阅例如WO96/40788)。这些试剂结合FcR但不诱导它们的内陷，并且因此与加工和抗原递呈有关(T.Keler等.2002JImmunol.165:6738-6742)。在结合具有充分地高度亲合力情况下，Fc受体内陷由免疫球蛋白(通过Fc结构域)与FcR的结合诱导(A.Yada等.2003CellImmunol225(1):p21-32,P.T.Harrison等.1994JBiolChem.269(39):24396-24402)。尽管这种结合相互作用能使用修饰的完整的免疫球蛋白来模拟，所述免疫球蛋白含有通过CDR-嫁接插入到可变区的外来序列(WO02/058728)，但并不清楚是否Fc结构域是必需的和/或足以请导FcR的内陷(P.T.Harrison等.1994JBiolChem.269(39):24396-24402,AYada等.2003CellImmunol225(1):p21-32)。此外，也不清楚关于是否Fc结构域本身足以诱导FcR的内陷。事实上，Fc结构域已广泛地用于延长治疗性蛋白的循环半衰期，并且关于细胞因子和其他免疫调节剂开发出多种Fc融合蛋白例如TNFR-Fc融合蛋白Etanerc印t(ENBRELTM)。继广泛的实验研究和创新思考之后，本发明人鉴定了在配体结合后内陷FcR所需的因子。本发明的融合蛋白包括抗原性多肽序列和结合FcR的多肽。而且本发明的融合蛋白诱导针对抗原性序列的免疫应答。选择融合蛋白中提供的结合FcR的多肽使得它以足够的结合亲合力结合Fc受体，以至于发生Fc受体和所结合的融合蛋白的内陷。FcR/免疫结合复合物的内陷允许免疫结合物净皮细胞的抗原加工途径加工。抗原加工引起免疫结合物被破坏成片段，并且这些片段被递呈到免疫系统的细胞。当所结合的Fc受体的内陷没有被诱导时，配体的结合仅形成通过Fc受体的胞质部分介导的细胞内信号传导。尽管这种信号传导对免疫应答有贡献，但它不足以引起FcR内陷，因此不会发生复合到FcR配体的任何抗原性肽的加工和递呈。流感病毒是正黏病毒，其分为三种类型；A、B和C。A型流感病毒能根据它们的表面蛋白血球凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)划分为亚型。有14种已知的H亚型和9种已知的N亚型。所有H亚型已在禽中发现，然而仅有3种H亚型(H1、H2和H3)和2种N亚型(Nl和N2)被^Jt通常在人类中流行。人类中季节性流感流行(Seasonalinfluenzaepidemics)与血球凝集素和神经氨酸酶蛋白中的抗原性位点中氨基酸改变有关，所述氨基酸改变在称为'抗原性漂移，的过程进行。主要的广泛流行与引入新的血球凝集素和神经氨酸酶基因(来自于动物衍生的流感病毒)有关，在称为'抗原性转变，过程中通过再分布到达当前流行的人类病毒的遗传背景中。当前，没有针对H5N1的疫苗使用于人类。根据WHO,针对H5N1的2003抹开发的疫苗对于2004越南H5N1林不具有保护性。对于人类治疗使用的疫苗的开发直到人对人可传播林的出现才成为可能，并且这会花费许多个月来准备用于大范围施用。相应地，通过使用得自感染抹的疫苗来预防广泛流行的流感，不是控制疾病传播的可靠方法。因此，非常期望开发广谱治疗剂用以预防和治疗多种流感抹和亚型的感染。本发明的发明人令人惊奇地提供了Fc蛋白-抗原融合蛋白免疫结合物，其能够介导针对病原体(免疫结合物的抗原部分从其中衍生)的长期保护性免疫。针对病原体介导的免疫通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答诱导，其中所述应答令人惊奇地在缺乏明显的中和抗体应答成分条件下介导。这是重要的，因为通常认为免疫应答的体液成分是必需的，其是为了使疫苗在施用该疫苗的受治疗者中调节长期保护性免疫。本发明的融合蛋白能令人惊奇地诱导免疫应答，所述免疫应答提供给受治疗者不仅针对病原体的特异林，而且针对病原体的进一步相关抹(其可以起因于例如突变或抗原性漂移)的保护性免疫。令人惊奇地，这种免疫的施与基本上在施用本发明融合蛋白免疫结合物的受治疗者中没有引起明显的体液应答，因此，抗体的产生和血清转换基本上对于受治疗者中抗病原体的长期保护性免疫没有贡献。本发明人鉴定了所述免疫结合物在针对感染性疾病、例如通过病毒病原体(例如HIV和尤其是流感病毒，其中例如抗原性转变和抗原性漂移引起感染原变化的事件)介导的疾病病症介导长期保护性免疫中有特殊效用。而且，所述免疫结合物在诱导针对病原体(显示高度的序列突变和变化速率)的免疫应答中也有特殊效用。
发明内容9依照本发明的第一方面提供了一种融合蛋白，其包括一种或多种抗原性多肽序列和结合FC受体的多肽，所述结合FC受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。术语"足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力"是指配体以引起所结合的复合物内陷入细胞的结合亲合力来结合Fc受体。这导致本发明的结合的融合蛋白被细胞的抗原加工途径加工。这又导致融合蛋白被破坏并且依靠主要组织相容性分子(MHC)使其陈列在细胞表面，这些MHC将肽片段递呈到免疫系统的细胞。如本文定义的，术语"内陷"指细胞内吞以及尤其是指受体介导的细胞内吞或Fc介导的吞噬作用。细胞内吞是摄取大分子或颗粒到细胞中的过程。关于本发明，在Fc受体以足够的亲合力被配体结合而发生Fc受体和所结合配体内陷的情况下，尤其发生内陷。在一个实施方式中，为诱导内陷，通常融合蛋白的结合Fc受体的多肽需要以从约10—6Kd至约10—9Kd的结合亲合力解离速率常数来结合Fc受体。在另一个实施方式中结合Fc受体的多肽和Fc受体之间的结合亲合力是在约1(TSKd至约10巧Kd之间。在另一个实施方式中，本发明融合蛋白的结合Fc受体的多肽和Fc受体之间的结合速率常数，在从约lxlO6Ka至约3xl()9Ka之间。在某些实施方式中结合Fc受体的蛋白得自免疫3求蛋白(通常是人免疫球蛋白)的重链。通常免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgG，而且相应地结合Fc受体的蛋白能得自人IgG的重链，尤其是得自IgG亚型IgGl的重链或IgG亚型IgG3的重链。在某些另外的实施方式中，结合Fc受体的蛋白包括人免疫球蛋白IgGl的CH2恒定区或人免疫球蛋白IgG3的CH2恒定区。人IgGl或人IgG3的CH2恒定区也称为CY2结构域或C2结构域，这种替代的命名得自被指定为y链的人IgG重链。在另外的实施方式中，具体而言，其中的结合Fc受体的蛋白得自人免疫球蛋白IgGl或人免疫球蛋白IgG3，存在于结合Fc受体的蛋白内的C丫210结构域的序列在第297位(N297)的天冬酰胺(Asn,N)残基保有高度保守的N联糖基化(N-linkedglycosylation)位点。所述残基的糖基化在介导高亲合力结合和激活Fc受体方面被鉴定为具有重要性。不希望受到理论限制，本发明人预测IgG重链C2恒定区中，在第297位残基存在的糖基化残基，促成了具有重要性的三级结构，其允许结合Fc受体。具体而言，预测了更多的氨基酸残基(其存在于CH2恒定区序列中)或其片段(其可能存在于融合蛋白的结合Fc受体的多肽内)在N297糖基化位点附近折叠，这引起N297残基被局限于临近残基的内部或基本上被临近残基包裹。这种折叠形成能被Fc受体结合的三级结构。相应地，在这个位置存在的糖基化残基，在作为一种构架中具有重要性，所述构架允许结合Fc受体的多肽中更多氨基酸在那附近折叠。在合成序列中，在所述位置或在等同于这个位置的残基中缺失糖基化残基影响Fc受体结合。在另一个实施方式中，可对编码结合Fc受体的多肽的多核苷酸序列进行定点诱变。这种诱变通过置换、添加或缺失而用以改变编码序列。产生的多核苷酸序列的变化能改变结合Fc受体的亲合力。本发明因此进一步延伸至结合Fc受体的蛋白，其包括得自人免疫球蛋白IgG(通常是IgGl或IgG3亚型的IgG免疫球蛋白)的Cy2结构域，所述结构域在它的氨基酸序列中遭受至少一种突变。例如，所述突变可能关于在第298位丝氨酸残基被丙氨酸残基置换、和/或在第295位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基置换。当提供具有特异性突变的CH2结构域序列时，可以从合成的基因构建体编码多核苦酸。相应地在另外的不同的实施方式中，结合Fc受体的多肽包括CH2恒定区或其片段，所迷CH2恒定区或其片段包括在第297位的天冬酰胺残基。所述序列可以进一步包括在第298位的甘氨酸残基和/或在第295位的丙氨酸残基。所述序列可以进一步包括在第234和235位的亮氨酸残基。在另一个实施方式中结合Fc受体的多肽包括CH2恒定区或其片段，所述CH2恒定区或其片段包括在第297位的天冬酰胺残基。所述序列可以进一步包括在第298位的甘氨酸残基和/或在第295位的丙氨酸残基。在第234和235位的亮氨酸残基。如本文参考和/或修饰的特异性氨基酸残基的位置是指应用于人IgG重链恒定区的残基编号。通常，这种编号因而会涉及对氨基酸残基规定的编号，所述氨基酸残基存在于人免疫球蛋白IgG的CH2恒定区。应理解本发明的结合Fc受体的蛋白可以包括CH2恒定区的片段、衍生物、类似物或变体。在这些情况下，应用于存在于这种序列中的氨基酸残基的编号可以改变，这取决于序列长度。相应地，例如天冬酰胺残基，其存在于所定义的CH2结构域恒定区(例如得自Kabat数据库)的第297位残基，但所述天冬酰胺残基可以与融合蛋白或结合Fc受体的多肽的氨基酸序列第297位残基的位置无关。在这些情况下，应可以理解技术人员将使用序列比对方法鉴定残基位于结合Fc受体的多肽序列的什么位置，所述残基等同于Kabat数据库定义的人IgGCH2的第297位天冬酰胺残基。如本文所应用的，对于特定氨基酸(其是关于Fc受体结合结构域)规定的编号，M于所等同的残基的编号，所述所等同的残基是由得自Kabat数据库序列的IgG重链恒定区定义。具体而言当多肽是得自CH2恒定区或为其片段时，相同情况作适当变动应用于对于结合Fc受体的蛋白具有重要性的其他残基，例如在第298位的丝氨酸残基和/或在第295位的谷氨酰胺残基。在一个实施方式中结合Fc受体的蛋白包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。像这样，所述实施方式的融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列，连同含有SEQIDNO:l的氨基酸序列的结合Fc受体的多肽。在另一个实施方案中，结合Fc受体的蛋白包括如SEQIDNO:l所显示序列的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有多肽(其含SEQIDNO:l的序列)的生物活性。SEQIDNO:1:EPGC[M1.1CeeCEME11CCEfA['IEEtfef[11^U-F1EB1CW"'、,'￡tE[Ee:\》:ev[c\e、t:wuef:eegwi'x.f\￡、11工tci:固w！fcp\￡:fMWEIEP1IS附KEF5EWIIEESFIEI1P、C'、5I"KIWC;FW^IME^具体而言，SEQIDNO:l详述了一种多肽，其能结合Fc受体。所述序列能与为IgG重链恒定区鉴定的序列(如Kabat数据库中SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(www.kabatdatabase.com)所定义的)的第216至447位残基比对。以下述内容为基础SEQIDNO:l中第一氨基酸残基被编号为第216位残基、以及最后的残基编号为笫447位残基；然后可在第297位残基提供天冬酰胺(Asn,N)残基，其能被糖基化。SEQIDNO:l中在第415位残基的甘氨酸残基(G,Gly)代表了丝氨酸(S,Ser)残基的置换，所述丝氨酸(S,Ser)残基存在于Kabat数据库定义的序列中。SEQIDNO:l进一步包括了在第393位的丙氨酸(A,Ala)残基，所述丙氨酸(A，Ala)残基取代了在Kabat数据库定义的序列中提供的苏氨酸残基(Thr,T)。SEQIDNO:l的序列可以进一步突变使得在第298位的丝氨酸(Ser,S)残基能被丙氨酸残基(Ala,A)置换。此外，为了创造融合蛋白的突变体形式，所述融合蛋白包括SEQIDNO:l的序列(如结合Fc受体的多肽)，例如可以将SEQIDNO:l中在第234和235位残基提供的两个亮氨酸残基分别突变成为如缬氨酸和丙氨酸的残基，以削弱Fc受体结合。在另一个实施方式中，可以突变具有SEQIDNO:2序列的结合Fc受体的多肽，使得在第393位的丙氨酸(Ala,A)残基改变为如存在于Kabat数据库序列中的苏氨酸(Thr,T)残基。SEQIDNO:2序列提供如下SEQIDNO:2:EXHm^E"'EW.:MFlPEFEEO〖、5"F"￡VLW工〖-GI附￡iK，IJEMIEP'II￡,GCfF￡K\HHE￡FCE11PKWIC:"PGEWS匸1服￡SISC:CE￡mI511EE'、IES.CGSEE工，iSM1\[FGFKCG"￡SCS\H￡MFm"I^l<￡II￡:!EI*相应地在另一个实施方式中，结合Fc受体的蛋白包括如SEQIDNO:2显示的序列。像这样，所述实施方式的融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列，以及含有SEQIDNO:2的氛基酸序列的结合Fc受体的多肽。仍旧在另一个实施方式中，结合Fc受体的蛋白包括如SEQIDNO:2显示序列的片段、变体或衍生物，其具有含SEQIDNO:2的多肽的生物活性。SEQIDNO:2的序列可以进一步突变使得在第298位的丝氨酸(Ser,S)残基被丙氨酸残基(Ala,A)置换。此外，为了创造融合蛋白的突变体形式，所述融合蛋白包括SEQIDNO:2的序列(如结合Fc受体的多肽)，例如可以将SEQIDNO:2中在第234和235位残基提供的两个亮氨酸残基分别突变成为如缬氨酸和丙氨酸的残基，以削弱Fc受体结合。图5显示SEQIDNO:l与人IgG重链恒定区的第216至447位残基的序列比对，后者的序列称为SEQIDNO:3。在某些另外的实施方式中，结合Fc受体的多肽包括CY2结构域的片段、类似物或衍生物，所述CY2结构域得自人免疫球蛋白IgG，通常是IgGl、IgG2或IgG3。在某些另外的实施方式中，结合Fc受体的多肽除了包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或得自人免疫球蛋白IgG的C^2结构域外，可以进一步包括另外的恒定区和/或4交链区，所述恒定区例如但不限于C/3恒定区，所述铰链区例如包括存在于Cy2和Cy3恒定区之间、富含脯氨酸的氨基酸段的铰链，所述铰链区对结合Fc受体的多肽赋予结构灵活性。通过共价键方式可以将一种或多种抗原性多肽序列连接到例如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的结合Fc受体的多肽。可选"^奪地可以使用非共价键。在另外的实施方式中，连接体部分或间隔区可以用于连接所述序列。通常结合Fc受体的多肽能够结合到Fc受体FqRI(CD64)和/或结合到Fc受体FcyRII(CD32),和/或结合到Fc受体FcyRIII(CD16)。在某些实施方式中，结合Fc受体的多肽能够结合到FcR，是通过在它的跨膜序列中的盐桥耦合到FcR的y链。如本文所描述的术语"抗原性多肽序列"是指当其被施用到受治疗者时，其针对所述多肽序列诱导长期保护性免疫应答的多肽。抗原性多肽可以从任何适合的来源得到，例如病原微生物或肺瘤特异抗原，或能从非病原性疾病得到，例如自身免疫性疾病或神经变性疾病。抗原性肽可以得自内源性正常蛋白的鉴定，所述内源性正常蛋白与给定病症的发病机制有关。在这些情况下，能使用全蛋白或其片段、类似物或衍14生物。在某些另外的实施方式中，抗原性多肽序列选自由病毒多肽、细菌多肽、肿瘤特异性多肽和免疫调节性多肽组成的组。所述多肽可以是完全蛋白、其片段或类似物，或者蛋白或多肽的衍生物。适合的抗原性多肽是病毒多肽，其中所述病毒选自由mv-i、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和A型流感病毒组成的组。其中当所述病毒多肽得自禽流感病毒，所述多肽可以得自A型流感病毒，所述A型流感病毒选自由H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7组成的组。在某些另外的实施方式中，可对编码抗原性多肽的多核苷酸序列进行定点诱变。这种方法具有引入所期望的遗传改变的额外优点，所述遗传改变例如除去抗原性蛋白中蛋白酶切割位点或可变环。例如除去流感病毒HA中HA1/2切割位点或HIVgpl20中的环，会产生诱导免疫应答的融合蛋白，所述免疫应答重新定向到这些抗原的较稳定的区域。在另外的实施方式中，完全通过化学合成能生产引入上述突变的抗原性多肽序列。在另一个实施方式中抗原性肽可以由多于一种基因的产物组成，例如异源融合抗原的产物，所述异源融合抗原例如基因融合物HIVtat/rev、流感病毒HA/NA或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196TB。所述异源融合抗原可以进一步通过化学合成生产。相应地在另外的实施方式中抗原性多肽包括抗原性多肽片段，所述抗原性多肽片段包括含有2个或更多的抗原性多肽的融合物。所述的2个或更多的抗原性多肽可以得自相同的病原体，或得自不同的病原体。例如在某些实施方式中，抗原性多肽包括HIV的tat和rev多肽或其片段的融合物。在另一个实施方式中，抗原性多肽包括血球凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)或其片段(例如得自流感病毒)的融合物。仍旧在另一个实施方式中，抗原性多肽可以包括结核病Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196基因编码的多肽的融合物。仍旧在另外的实施方式中，能合成地例如通过化学合成而生产异源的抗原性多肽。适合的化学合成技术对于本领域技术人员是公知的，包括但不限于标准液相或固相肽合成方法。在另外的实施方式中，抗原性多肽是T细胞表位。所述T细胞表位可以是病原体表位或非病原体表位。在所有的实施方式中，T细胞表位应适合于当向受治疗者施用时介导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。在某些实施方式中，融合蛋白进一步包括一种或多种另外的异源多肽，例如免疫调节性肽(例如细胞因子)。本发明另一方面提供了一种免疫原性组合物，其包括本发明第一方面的融合蛋白。在某些另外的实施方式中，免疫原性组合物进一步包括佐剂。在另一方面，本发明延伸至一种在受治疗者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括步骤为以足以引起免疫应答的量，向受治疗者施用本发明上述方面的免疫原性组合物。通常，所述免疫应答是细胞毒性T淋巴细胞(CTU应答。在另一方面，本发明提供了，编码本发明第一方面的融合蛋白的多核苷酸序列或者编码至少一种多肽的多核苷酸序列，所述多肽是本发明第一方面的融合蛋白的组分。在一个实施方式中，多核苷酸编码具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2氨基酸序列的氨基酸。所述氨基酸能此后连接到至少一种抗原性肽片段、以形成本发明的融合蛋白。本发明的另一方面提供了一种载体，所述载体包括至少一种编码本发明融合蛋白或其多肽的多核苷酸序列。适当地所述载体包括至少一种控制序列元件，其可操作地连接到至少一种多核苷酸序列。所述控制元件通常依赖于所述载体在其中被表达的细胞系进行选择。仍旧在本发明的另一方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明的载体或多核苷酸序列或融合蛋白。仍旧在本发明的另一方面提供了依照本发明产生融合蛋白的方法，所述方法包括在适合于产生融合蛋白的条件下孵育细胞或载体的步骤，所述细胞包括多核苷酸，其编码含有一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽的融合蛋白，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合FC受体，所述载体包括所述多核苷酸。在一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。依照本发明的另一方面提供了在受治疗者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤-提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体，以及-向受治疗者施用治疗有效量的所述融合蛋白，在所述受治疗者中期望得到针对所述抗原性多肽或其片段而诱导的免疫应答。疫应答，所述方法进一步包括的步骤为-获得源自病原体的抗原性多肽序列，其是所述疾病的成因或者是得自所述病原体的产物。-使用所述抗原性多肽序列以形成本发明第一方面的融合蛋白，以及-向需要该治疗的受治疗者施用治疗有效量或预防有效量的含有融合蛋白的组合物。通常抗原性多肽是得自细菌病原体、病毒病原体、寄生虫病原体或原生动物病原体。在另外的实施方式中所述方法进一步延伸至为治疗非病原性疾病病症而诱导免疫应答，所述方法进一步包括的步骤为-获得对于非病原性疾病病症特异性的抗原性多肽序列，-使用所述抗原性多肽序列以形成融合蛋白，以及-向需要该治疗的受治疗者施用治疗有效量或预防有效量的含有融合蛋白的组合物。在一个实施方式中融合蛋白包括结合Fc受体的多肽，所迷结合Fc受17体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中结合Fc受体的多肽包括含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的结合Fc受体的多肽。通常非病原性抗原性多肽选自由肺瘤特异性多肽、对于神经变性疾病具有特异性的多肽和对于自身免疫性疾病具有特异性的多肽组成的组。适合的免疫应答是细胞毒性T细胞应答。在一个实施方式中，受治疗者是哺乳动物。在另外的实施方式中所述哺乳动物是人。通常静脉内、皮下或月几内施用融合蛋白，由于这些组织含有表达Fc受体的树突状细胞、并且进一步所述组织缺乏高水平的血清IgG(其可能竟争结合Fc受体)时，优选这些途径。依照本发明的另一方面提供了一种在受治疗者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括的步骤为在允许表达所述多核苷酸并且产生所述融合蛋白的条件下，施用治疗有效量的多核香酸或基因递送载体到受治疗者的细胞，从而激发对于所述融合蛋白的免疫应答，所述多核苷酸或基因递送载体编码依照本发明第一方面的融合蛋白。适合地，免疫应答是细胞毒性T细胞应答。在一个实施方式中，受治疗者是哺乳动物。在另一个实施方式中所述哺乳动物是人。通常地，皮下、静脉内或肌内施用基因递送载体。在某些另外的实施方式中，其中所述受治疗者的细胞以多核苷酸或基因递送载体转染，所述转染是间接体内进行并且所转染的细胞随后再引入到受治疗者中。在一种替代方式中，在体内所述受治疗者的细胞被多核苷酸或基因递送载体转染。仍旧在本发明的另一方面提供了一种用于诱导免疫应答的药物组合物，其中所述药物组合物包括融合蛋白连同药学上可接受的赋形剂、载体18或稀释剂，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合FC受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。在一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。本发明的另一方面提供了一种用作药物的融合蛋白，所迷融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。在一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。仍旧在本发明的另一方面提供了融合蛋白用于制备治疗和/或预防疾病的药物的用途，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。在一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。在某些实施方式中所述疾病是病原性疾病。在这些情况下，通常病原性疾病是病毒感染，例如fflV-l、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或流感病毒的感染。在病毒感染是A型流感病毒的情况下，亚型可以选自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7。在另外的实施方式中所述疾病是非病原性疾病，例如但不限于癌性或恶性病症、神经变性疾病和自身免疫性疾病。通常地，所述药物的使用产生了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的诱导。在一个实施方式中，所述药物进一步包括佐剂。在一个实施方式中，以肌内或皮内施用而提供所述药物。通常地，所述药物是疫苗，其能^皮预防性地施用，以在受治疗者中针对病原体(融合蛋白的抗原性多肽片段从其中衍生)介导长期保护性免疫。通常地，所述药物是疫苗，其能被治疗性地施用，以在受治疗者中针对癌性病症(免疫结合物的抗原性多肽片段从其中衍生，所述抗原性多肽是肿瘤特异性抗原)介导长期保护性免疫。在某些实施方式中，所述疾病是病毒感染，例如但不限于fflV-l、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或流感病毒的感染。仍旧在本发明的另一方面提供了编码融合蛋白的多核苷酸用于制备治疗和/或预防疾病的药物的用途，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。通常地，所述药物的使用产生了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的诱导。本发明人也确定，本发明的融合蛋白可以连同其他治疗剂施用，以预防和/或治疗疾病。例如，一种包括依照本发明的融合蛋白的组合物可以与至少一种另外的治疗剂联合施用，其中在该融合蛋白中的抗原性多肽是得自感染性病毒的病毒多肽，所述组合物进一步包括至少一种药学上可接受的载体，所述另外的治疗剂具有对于病毒感染发生的预防和/或治疗效应。上述内容提供了联合治疗，其关于病毒感染方面有益，所述病毒感染具有特别高的致病性。相应地，本发明的另一方面提供了一种预防和/或治疗受治疗者中微生物感染的方法，所述方法包括的步骤为；-提供一种包括融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体，-向需要该治疗的受治疗者施用治疗有效量的所述组合物，以及-进一步施用治疗有效量的、适合的第二种抗微生物化合物(anti-microbialcompound)。在一个实施方式中，第二种抗微生物化合物是连同融合蛋白施用，然而，在另外的实施方式中，第二种抗微生物化合物可以是在施用融合蛋白之前施用或者在施用融合蛋白之后施用。在一个实施方式中，抗原性多肽得自病毒病原体并且第二种化合物是抗病毒化合物。所述第二种抗病毒化合物可以选自包括利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、奥塞米韦(TAMIFLUTM)和扎那米韦的组。在一个实施方式中，多肽(抗原性多肽)得自A型流感病毒。在另外的实施方式中，A型流感病毒是H5N1、H9N2、H7N2、H7N3或H7N7的才朱。仍旧在另外的实施方式中，A型流感病毒可以包括H5、H7或H9亚型的血球凝集素连同任何神经氨酸酶亚型。在另一个实施方式中，抗原性多肽得自肝炎病毒。在另外的实施方式中，肝炎病毒是乙型肝炎病毒并且优选的抗病毒化合物是拉米夫定(lamuvidine)。仍旧在另一个实施方式中，肝炎病毒是丙型肝炎病毒并且优选的抗病毒化合物选自利巴韦林和白细胞介素2(IL-2)或其组合。依照本发明的仍旧另一方面提供了本发明的融合蛋白和抗病毒化合物在制备用于治疗或预防A型流感病毒亚型H5、H7或H9感染的联合药物中的用途。在一个实施方式中A型流感病毒亚型是H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3或H7N7的抹。在一个优选的实施方式中，第二种抗病毒化合物可以选自包括利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、奥塞米韦(TAMIFLUTM)或扎那米韦的组。在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白可以作为药物施用，其在中断性抗病毒治疗进度(interruptiveanti-viraltherapyschedule)中与抗病毒化合物联合。仍旧在另一个实施方式中，本发明的多肽扼合物可以作为药物施用，其在HIV/AIDS的中断性抗病毒治疗中与三联疗法(triple-therapy)的抗病毒化合物联合。除非上下文另有要求，本发明每个方面和实施方式的优选的特征，包括对其他方面根据情况作适当变动的每一种。图1显示的曲线图显示了关于依照实施例3的方案免疫的动物的体重减轻数据，图2显示FACS分析的结果，其显示融合蛋白与人THP-1细胞上的Fc受体的结合，图3显示FACS分析的结果，其显示融合蛋白与RAW细胞(小鼠树突状细胞)上的Fc受体的结合，图4显示FACS分析的结果，其显示融合蛋白与人THP-1细胞上的Fc受体的结合，以及图5显示序列比对，其显示SEQIDNO:l的tt酸序列(*表示靠上的序列)，与如得自Kabat数据库的IgG的重链恒定区的第216至447位残基(SEQIDNO:3)("表示靠下的序列)的比较。具体实施例方式本发明提供融合蛋白和相关的结合的复合物，所述融合蛋白包括结合Fc受体的蛋白，所述结合Fc受体的蛋白以足以引起Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。Fc受体内陷允许有效的抗原递呈以刺激T细胞应答。与胞饮作用刺激辅助性T细胞应答相比，Fc受体内陷明显地更有效。然而，本发明人令人惊奇地显示，Fc受体连同相关抗原的内陷能形成有效的抗原加工，其不仅能产生辅助性T细胞应答，而且能产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)通过直接细胞毒性作用以及通过向其他免疫细胞提供特异性和非特异性辅助作用，靶向和破坏患病的或异常细胞，所迷其他免疫细胞例如巨噬细胞、B细胞和其他类型的细胞。本发明的结合FC受体的融合蛋白的内陷显示激发针对所述融合蛋白内提供的抗原或抗原性片^R的特异性CTL应答。这因此提供了关于诱导长期保护性免疫应答的有效方法，其中所述保护性免疫应答是期望针对例如感染性疾病、癌性病症和3申经变性疾病的病症。本发明的融合蛋白可以通过主要的氨基酸序列ABC定义，其中A指一种或多种抗原性多肽序列，B是任选的连接体部分并且C是结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。在一个实施方式中，A定义为多肽的N末端(氨基)部分并且C定义为多肽的C末端(羧基)末端。在这样一个实施方式中，如果连接体用于结合A和C，连接体就会结合到定义为抗原性多肽片段的氨基酸序列的C末端，并且结合到定义为结合Fc受体的多肽的氨基酸序列的N末端。在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的结合Fc受体的多肽得自人免疫球蛋白的Fc部分的至少一种恒定区，通常是CH2结构域或其变体。特别优选得自人免疫球蛋白的恒定区。不同种类的人免疫球蛋白适合于提供免疫结合物的结合Fc受体的多肽。抗体的种类或"同种型"通过其重链定义。具体而言，最优选IgG同种型的免疫球蛋白，然而IgA、IgM、IgE和IgD同种型的抗体在本发明的各种另外的实施方式中也可以应用。通常，融合蛋白的结合Fc受体的多肽得自人抗体，通常是IgG同种型的抗体。IgG有许多亚类，例如IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。每种IgG亚类均具有很高水平的同源性的恒定区，然而在铰链区每种同种型有明显区别。适当地，使用得自人免疫球蛋白IgGl重链的Oy2恒定区，或其片段、类似物或衍生物。尽管IgG的任何亚类在本发明中均可应用，然而，通常使用得自IgG亚类IgG3的序列，所述序列编码至少一种恒定区或其片段。本发明人也鉴定IgG3抗体的结构也特别适合于本发明，其是由于扩展的铰链区的存在。抗体的4交链区通常位于CH1恒定区和CH2恒定区之间，并且^皮认为提供给抗体结构的灵活性，以促进被抗体的Fab部分结合。抗体的恒定区在指导免疫应答，以及具体而言在效应子功能的募集中具有重要性，所述效应子功能在抗体结合之后介导免疫应答。结合抗体之后诱导的效应子功能的类型取决于重链的恒定区，尤其是CH2和CH3结构域。在抗病原体的持续保护中，从免疫系统诱导应答以提供长期保护性免疫的能力具有重要性。这种应答的一种固有的部分是结合和激活FcR。FcR存在于免疫系统的多种细胞，例如抗原递呈细胞，以及具体而言巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和小结树突细胞。配体结合到FcR产生许多效应子机理的激活，例如补体激活、ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和免疫介质(例如细胞因子)的释放。Fc受体具有抗体类型特异性和同种型选择性。本发明的实效在于本发明的融合蛋白以足够高的结合亲合力结合FcR的能力，以诱导所结合的FcR内陷入表达所述FcR的细胞。这种结合产生了许多效应子机理的激活，例如释;^文免疫介质例如趋化因子和细胞因子。如在上文中讨论的，在FcR以足够高的结合亲合力(结合亲和力)被配体结合的情况下，FcR的结合也能产生FcR的内陷。也能够上调抗原递呈，这样产生了细胞对于融合蛋白增强的摄取和递呈，所述细胞表达Fc受体。已知有三类FcR具有对于IgG的结合特异性，每一种均具有归于此的(ascribedthereto)特殊功能。FcyRI(也称为CD64)存在于巨噬细胞和单核细胞表面。FcyRII(CD32)在B细胞、巨虔细胞、中性粒细胞和单核细胞表面表达。最后地，FcyRIII(CD16)由巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞表达。对于其他抗体同种型具有特异性的FcR包括FceRI和FcsRII，其由B细胞、单核细胞和小结树突细胞表达，并且其具有对于lgEFc部分的特异性；FcoR，其具有对于IgAFc部分的特异性，以及FcpR，其具有对于IgMFc结构域的特异性。相应地，在一个实施方式中，免疫结合物的结合Fc受体的多肽部分能够结合至少一种Fc受体，所述Fc受体选自包括FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)或FcyRIII(CD16)的组。在一个优选的实施方式中，结合Fc受体的24多肽能够结合FcyRI(CD64)和FcyRIII(CD16)。在一个更优选的实施方式中，结合Fc受体的多肽能够结合FcR，这是通过它们的跨膜结构域内的盐桥耦合到FcRy链。通常，本发明的免疫结合物的Fc部分主要包括(iscomprisedof)定义为IgGl抗体的CH2恒定区的氨基酸序列或其变体或片段。具体而言，CH2恒定区或其变体或片段(也指的是作为CH2恒定区),可以得自人IgGl抗体的重链。可选择地，本发明的融合蛋白的Fc部分主要包括定义为IgG3抗体的CH2恒定区的氨基酸序列或其变体或片段。在一个优选的实施方式中，CH2恒定区(也指的是作为C2恒定区)，得自人IgG3抗体的重链。在某些另外的实施方式中，结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。仍旧在另一个实施方式中，结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。多肽(编码结合Fc受体的多肽)可以通过重組方法获得，或者可选择地可以合成地生产。在另一个实施方式中，免疫球蛋白分子经蛋白酶水解之后可以获得结合Fc受体的结构域，例如通过木瓜蛋白酶水解免疫球蛋白。通过本领域已知的任何方法包括化学键，抗原性肽可以任何方法耦合到Fc。例如，结合能包括使用化学交联分子，例如使用异双功能交联剂(heterobifunctionalcrosslinkingagent)，例如琥珀酰亚胺酯，例如3-(2-二硫代吡咬基)丙酸酯或者琥珀酰亚胺硫代乙酰乙酸酯(succinimidy1acetylthioacetate)(MolecularProbesInc.Handbook,第5章，第5,3部分)。通过与其他化学部分形成共价的或聚集的结合物，抗原性多肽片段可被修饰以产生衍生物，所述其他化学部分例如糖基基团、聚乙二醇(PEG)基团、脂质、磷酸酯和乙酰基及类似物。通过连接化学部分到氨基酸侧链或者在抗原性多肽的N末端或C末端的官能团，能够制备本发明的多肽的共价衍生物。适合地，抗原性多肽A得自病原微生物。可选择地，抗原性多肽A得自负责病原性加工的蛋白质，所述病原性加工引起宿主的疾病或病变(illnessordisease)。抗原性多肽A可以进一步得自病原体，所述病原体是感染性疾病的成因。可选择地，抗原性多肽A得自负责病原性加工的蛋白质，所述病原性加工引起宿主的疾病或病变。此外，抗原性多肽A可以得自分泌的产物或其他感染原，所述分泌的产物或其他感染原得自病原微生物。抗原性多肽可以进一步是合成的。关于产生这种合成的蛋白质的技术对于本领域技术人员是广泛知晓的。在另外的实施方式中，抗原性多肽可以是病毒肽、细菌多肽、肿瘤特异性多肽、对于神经变性疾病具有特异性的多肽、对于自身免疫性疾病具在另外的实施方式中，抗原性肽或其片段是T细胞表位。T细胞表位能够使用已知算法预测或者作为肽合成，并且能够使用标准T细胞测定而筛选。鉴定的T细胞表位可以是细胞毒性T细胞表位，并且可以具有优选的从9至20个氨基酸的氨基酸长度。仍旧在另一个实施方式中，抗原性多肽得自分泌的产物或其他感染原，所述分泌的产物或其他感染原得自病原微生物。具体而言，分泌的产物可以得自细菌病原体，并且分泌的产物选自由杀白细胞素、链球菌溶血素S、链球菌溶血素O、NAD酶、透明质酸酶、链激酶和致热性外毒素组成的组。在一个实施方式中，感染性疾病由微生物病原体引起。在另一个实施方式中，感染性疾病由细菌病原体引起。在另一个实施方式中，感染性疾病由真菌病原体引起。在另一个实施方式中，感染性疾病由病毒病原体引起。在另一个实施方式中，感染性疾病由肺瘤特异性病原体引起。在一个实施方式中，抗原性片段是病毒多肽。在另一个实施方式中，抗原性多肽片段得自流感病毒的抹，其能在人类中引起感染。通常，抗原性片段是血球凝集素(HA或H)或其片段，其得自A型流感病毒的感染性抹。可选择地，抗原性片段是A型流感病毒的HA3组分。在另一个实施方式中，抗原性多肽可以得自A型禽流感病毒。通过H5、H7或H9亚型的血球凝集素的存在，可以确定A型禽流感病毒。在另外的实施方式中，A型流感病毒是H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3或H7N7的抹。仍旧在另外的实施方式中，A型流感病毒可以包括H5、H7或H9亚型的血球凝集素连同任何神经氨酸酶亚型。在另一个实施方式中感染性疾病是肝炎，具体而言其是由丙型肝炎病毒引起。仍旧在另一个实施方式中感染性疾病是肝炎，具体而言其是由乙型肝炎病毒引起。仍旧在另一个实施方式中感染性疾病是HIV,其是由HIV-1或HIV-2逆转录病毒引起。在另外的实施方式中，抗原性多肽可以得自任何病原体，宿主被所述病原体感染后其中至少一种抗原介导免疫应答。这种病原体具体而言指的是作为'感染原，或'感染性疾病，的组，并且可以是病毒感染性疾病，其选自但不限于包括流感、鼻病毒(普通感冒)、冠状病毒(例如严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒)、逆转录病毒(例如HIV)、人乳头瘤病毒、天花、狂犬病、风渗、肝炎、单纯疱渗病毒、带状疱渗病毒、病毒性脑膜炎、黄热病、西尼罗病、鸡痘(水痘)和口^帝疫病毒(FMDV)的组。抗原性多肽可以进一步得自细菌感染性疾病，其选自但不限于由结核病、伤寒、炭疽、细菌性脑膜炎、霍乱、白喉、淋病、军团杆菌病、钩端螺旋体病(leptispirosis)、李斯特菌病、MRSA感染和百日咳组成的组。抗原性多肽可以进一步得自寄生虫感染性疾病，其选自但不限于由利什曼病、症疾和锥虫病、真菌感染性疾病例如脚裤和念珠菌病、朊病毒感染性疾病例如牛海绵样脑病和Creutzfeldt-Jakob病(CJD)组成的组。仍旧在另一个实施方式中，抗原性片段可以得自负责发病机制的宿主蛋白质。这种蛋白质包括但不限于，在Alzheimer's病中引起发病机制的淀粉状蛋白质、牵涉在烟碱成瘾性中的烟酸受体和牵涉在动脉粥样硬化发病机制中的胆固醇转移酶CTEP。本发明的融合蛋白在治疗癌性或恶性病症中有进一步的效用。施用给受治疗者本发明的包括肺瘤特异性抗原的融合蛋白之后产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的诱导，提供了一种治疗方法，当以治疗有效量施用给需要这种治疗的受治疗者时，所述治疗方法能够明显地抑制肿瘤细胞的生长。融合蛋白、编码融合蛋白的多肽或者包含编码融合蛋白的多肽的载体，可以连同佐剂向受治疗者施用。佐剂可以与融合蛋白同时施用，或者与融合蛋白依序地施用。佐剂的作用是非特异地刺激受治疗者的免疫系统。依照本发明的方法可以提供的佐剂，包括但不限于明矾、MF59、QUIL-A(QuilA皂苷)、解毒物(detox)、ISCOM、细胞因子、鲨烯、多元醇、多聚阴离子、肽、蛋白质、氢氧化铝、普卢兰尼克(pluronic)、油脂和乳剂。抗原性多肽可以在它的N-(氛基)末端或C-(羧基)末端与结合Fc受体(FcR)的多肽结合。然而通常地是，编码抗原性多肽的氨基酸序列设在免疫结合物的氨基(N)末端区域，而关于编码结合FcR的多肽的氨基酸序列设在免疫结合物的羧基末端。上述表示为A和C的第一和第二序列，可以通过任何适当的技术结合，但是通常通过共价键连接。然而也可以使用非共价键。可选择地，能够直接结合或能通过连接部分或间隔区的方式结合多肽序列。可以使用连接体部分例如得自免疫球蛋白的4交链区。铰链区作用不仅是连接定义为抗原性多肽的氨基酸、与定义为免疫结合物的结合FcR的多肽的氨基酸，而且提供给免疫结合物增加的灵活性，灵活性能够给予改善的结合特异性。通常，连接体主要充当间隔区。通常连接体主要包括通过肽键连接在一起的氨基酸。连接体例如可以包括1至20个氨基酸。适当地连接体可以包括空间上无阻隔的氨基酸残基，例如甘氨酸和丙氨酸。连接体部分的适合的形式在下文中描述。定义免疫结合物的抗原性片段的tt酸，可以以它的N-(氛基)末端或C-(羧基)末端连接到连接体部分。适合的结合和连接技术对于本领域技术人员是广泛知晓的，并且可以包括例如，利用Fc多肽的半胱氨酸残基通过硫代酸酯交联的结合。可选择地，所述结合能包括化学交联分子的使用，例如使用异双功能交联剂，例如琥珀酰亚胺酯，例如3-(2-二硫代吡咬基)丙酸酯或者琥珀酰亚胺硫代乙酰乙酸酯(MolecularProbesInc.Handbook,第5章，第5.3部分)。在抗原性片段与结合Fc的多肽的结合中可具有效用的进一步的技术包括，已公布的国际专利申请第WO94/04690和WO96/27011号中描述的技术。以遗传方法通过重组DNA技术的使用可进一步获得结合，所述方法和技术是本领域广泛知晓的，例如那些在Sambrook等的教导中阐述的。在MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.第1巻，第1.101-104页，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)和F,M.Ausubel等.CurrentProtocolsinMolecularBiology,编辑.J.WileyPress(2006)中，其相关部分通过引用并入本文。在一个实施方式中，通过使用适当的表达载体中的抗原性区域和结合Fc的多肽的、连续的基因融合体(contiguousgenefusion)，产生融合蛋白。在某些实施方式中，基因可以包括编码包括SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另外的实施方式中，基因可以编码包括SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽序列。现已确定结合Fc受体的多肽的糖基化具有重要性，以促进Fc受体的结合，其结合是以足够的结合亲合力诱导Fc受体内陷。具体而言，如在上文中提及的，其中结合Fc受体的多肽得自人IgGl，优选具有Cy2恒定区第297位的天冬酰胺(ASN,N)残基的N-连接的糖基化(如参考IgG的重链恒定区的序列所定义的，所述IgG从Kabat数据库中定义)，如在上文中描述的，因为这个残基的糖基化已知在介导高亲合力结合和Fc受体的激活中具有重要性。像这样，本发明另外的方面延伸至在一种细胞类型中产生结合Fc受体的多肽，其允许所述多肽经过翻译后修饰使得其被糖基化。在某些实施方式中，结合Fc受体的蛋白可此后结合到连接体部分和/或至少一种抗原性多肽片段，或者可选择地，融合蛋白可以在糖基化的细胞中完整的表达。相应地，仍旧在本发明的另一方面^是供了产生融合蛋白的方法，所述方法包括的步骤为-在细胞内表达结合Fc受体的多肽，其以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合FC受体，所述细胞能糖基化其表达的多肽，以及-在所述细胞中进一步表达至少一种抗原性多肽或其片段。在一个实施方式中结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一个实施方式中结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一个实施方式中，从连续的多核苷酸序列(核酸序列)表达结合Fc受体的蛋白和抗原性片段，所述连续的多核苷酸序列可以描述为融合基因。从框架内编码结合Fc受体的蛋白的多核苦酸序列中除去终止密码子，并且结合编码抗原性多肽或其片段的多核苷酸序列，可以形成融合基因。多核苷酸可以在载体中提供，其中多核苷酸序列的表达可操作地与控制元件连接，在细胞中所述控制元件具有表达的相容性。所述方法可进一步包括在细胞内表达多核苷酸的步骤，所述多核苷酸定义为连接体部分或间隔区，其中所述连接体部分或间隔区连接结合Fc受体的多肽和抗原性多肽。尽管本发明的融合蛋白以单体形式提供，在另外的实施方式中，可以以二聚体融合分子提供融合蛋白，这由两种融合蛋白的二聚作用形成。产生的二聚体可以是同源二聚体，其包括具有完全相同的抗原性多肽的2种融合蛋白。可选择地，二聚体可以是异源二聚体，其通过结合具有不同的抗原性多肽的2种融合蛋白形成。在融合蛋白显示不同的抗原性多肽的情况下，所述抗原性多肽可得自不同的病原微生物，或者可以得自相同的病原微生物或病原性产物的不同耙位点。可选择地，除病原微生物外，抗原性多肽可以得自例如如本文描述的非病原性疾病病症和癌性病症的来源。在本发明的另外的实施方式中，可以以多聚体分子提供融合蛋白。这种多价体融合蛋白可以使用结合Fc的区域形成，所述结合Fc的区域得自抗体的Fc区域或其部分，所述抗体通常呈现多价体形式，例如IgM(五聚体结构)或IgA(二聚体结构)类的抗体。在多价体融合蛋白分子形成的情况下，所述融合蛋白可以包括相似的或不同的抗原性多肽。仍旧在另外的实施方式中，融合蛋白可以由此进一步结合分子或化合物，所述分子或化合物可以在介导或增强免疫应答中具有效用。被配体结合后监控Fc受体是否内陷的方法和技术对于本领域技术人员是广泛知晓的。例如，可以获得Fc受体/融合蛋白结合的复合物的内陷的显像，其是通过使用例如细胞的免疫荧光或免疫细胞化学标记的技术实现，所述技术对于本领域技术人员是广泛知晓的。在本发明的一个实施方式中，荧光蛋白区域融合到结合Fc的多肽，以显像结合并且鉴定适当的结合Fc受体的肽。这样的内陷筛选可用于鉴定结合Fc受体的蛋白，其以引起Fc受体/结合Fc受体的多肽的复合物内陷的足够的亲合力来结合Fc受体。尽管可以使用任何适合的抗原递呈细胞进行这种研究，但是优选使用树突状细胞。在本发明的一个实施方式中，荧光蛋白区域融合到Fc结构域序列中，以显像结合并且鉴定适当的结合FcR的片段，所述适当的结合FcR的片段对于多肽免疫结合物具有效用。施用本发明的融合蛋白可以单独施用但优选作为药物组合物施用，所迷药物组合物通常包括适合的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，其取决于预期的给药途径进行选择。适合的药学载体的例子包括水、甘油、乙醇及类似物。经由任何适合的途径本发明的融合蛋白可以向需要该治疗的患者施用。如本文详述的，优选通过皮下的、皮内的或肌内的途径的方式肠胃外地施用组合物，以加强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的发展。施用的途径可以进一步包括粘膜(包括肺)和口腔。在优选的实施方式中，组合物是作为可注射的组合物递送。对于静脉内注射，有效成分为肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有适合的pH、等渗性和稳定性。使用例如等渗赋形剂例如，氯化钠注射液、Ringer's注射液或乳酸盐Ringer's注射液，本领域相关的技术人员能够制备适合的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。用于治疗或预防疾病的有效量的组合物，可以在单次剂量方案(singledosageregimen)或多次剂量方案(multi-doseregimen)中提供。施用组合物也可以经由微球、脂质体、其他的微粒给药系统或持续释放制剂，其置于某些组织中包括血液。上文提及的技术和方案以及依照本发明可以使用的其他技术和方案的例子,能在Remington'sPharmaceuticalSciences,第18片反，Gennaro,A.R.,LippincottWilliams&Wilkins;第20版ISBN0-912734-04-3和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems;Ansel,H.C.等.第7版ISBN0-683305-72-7中发现，其公开的全部内容通过引用并入本文。剂量和剂量方案优选以"治疗有效量"施用组合物到个体，这足以对施用该组合物的个体显示益处。实际施用的剂量、施用的速度和时程将取决于，并且能参考后述的因素而决定被治疗病症的性质和严重度，以及因素例如被治疗患者的年龄、性别和体重以及施用的途径。进一步应考虑的是关于组合物的性质，例如其结合活性和在体内血浆中的寿命，制剂中融合蛋白的浓度，以及递送的途径、位点和速度。剂量方案能包括本发明组合物单次施用的剂量，或组合物多次施用的剂量。组合物能进一步地与其他治疗剂和药物依序地或单独地施用，所述其他治疗剂和药物用于治疗施用本发明的融合蛋白所治疗的病症。当施用本发明的融合蛋白时，适当地，可以利用从约10ng/kg/天至1mg/kg/天的剂量范围。优选以"治疗有效量"施用本发明的融合蛋白到个体，这足以显示对个体的益处。在感染性疾病的情况下，益处会包括减少感染或疾病症状。在其他疾病情况下，益处会包括減少疾病症状。实际施用的量，以及施用的速度和时程，取决于被治疗病症的性质和严重度。治疗的处方例如剂量的确定等，最终由全科医师和其他医生负责并酌情处理，而且通常考虑被治疗的疾病、患者个体的情况、递送的部位、施用的方法和执业医生已知的其他因素。32融合蛋白的一个例子是通过重组方法从2种或更多的蛋白质产生的蛋白质。通常，这可通过产生融合基因，在框架内从编码第一个蛋白质的DNA序列中除去终止密码子，并且添加第二个蛋白质的DNA序列而获得。如果需要能加入进一步的蛋白质。然后细胞表达DNA序列为单独的蛋白质。在另外的实施方式中，融合蛋白的多肽能彼此独立地表达，并随后结合形成融合蛋白。例如，融合蛋白的抗原性多肽组分可以直接得自病原微生物、癌性细胞或类似物，并且这种多肽被结合到融合蛋白的结合Fc受体的多肽。在另外的实施方式中，抗原性多肽片段是较大的多肽的片段，其得自病原微生物或癌性细胞，或此外其可从热休克蛋白中分离，其中抗原性肽片段结合到热休克蛋白中，形成热休克蛋白-抗原性肽片段复合物。在本发明的融合蛋白或肽(其有助于在细胞内产生)通过重组或另外的方式产生的情况下，优选以分离的和纯化的形式提供肽或融合蛋白。所述分离的和纯化的形式通常包括，融合蛋白或肽是游离的或基本上从物质中游离出来，所述物质与融合蛋白或肽在其产生的细胞中相关。当通过重组方法制备时，为促进融合蛋白的纯化，融合蛋白可进一步含有结合配体的序列，例如His-标记、FLAG-标记或GST-标记，其可以通过连接体的方式结合，所述连接体包括蛋白酶或化学试剂的切割位点，其能够释放2个独立的蛋白质实体。本发明融合蛋白的产生表达、分离和纯化本发明的多肽，可以通过任何适当的技术完成，包括但不限于下述内容包含DNA的表达载体可用于制备本发明的融合蛋白或融合蛋白的至少一种肽组分。产生融合蛋白或肽的方法包括，在促进肽表达的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞然后从培养物中回收所表达的肽，所述重组表达载体编码本发明的融合蛋白或肽组分。技术人员已知纯化所表达的多肽的方法可根据一些因素变化，这些因素例如所使用的宿主细胞的类型，以及被宿主细胞分泌的肽是否是细胞内、膜结合或可溶性的形式。33可以使用任何适合的表达系统。载体包括编码本发明的融合蛋白或肽的DNA(多核苷酸序列)，其可操作地连接到适合的转录或翻译调节性的核苷酸序列，所述调节性的核苷酸序列例如得自哺乳动物、禽、微生物、病毒或昆虫基因的序列。调节性序列的例子包括转录启动子、操纵基因或增强子，mRNA核糖体结合位点，以及控制转录和翻译的起始和终止的适当的序列。当调节性序列的功能涉及DNA序列时可操作地连接核苷酸序列。因此，如果启动子核苷酸序列控制DNA序列的转录，就可操作地将启动子核苷酸序列连接到DNA序列。复制起点和选择基因通常整合到表达载体中，所述复制起点在期望的(大肠杆菌)宿主细胞中赋予复制的能力，所述选择基因可用于鉴定转化体。此外，编码适当信号肽的序列(天然的或异源的)能整合到表达载体中。关于信号肽的DNA序列(分泌性导引部分)在框架内可以融合到本发明的核酸序列中，使得所述DNA起始转录和mRNA翻译，形成包括信号肽的融合蛋白。信号肽在预期的宿主细胞中具有促进肽的细胞外分泌的功能。在翻译过程中信号肽从肽中切除，但允许从细胞分泌融合蛋白或肽。本发明肽表达的适合的宿主细胞包括原核生物、高等的真核细胞和酵母。原核细胞、哺乳动物细胞，以及尤其是CHO细胞、HeLa细胞和COS细胞被特别优选用作宿主细胞。描述了对于哺乳动物、酵母、真菌、原核和昆虫细胞宿主而使用的、适当的克隆和表达载体，例如在Pouwels等.CloningVectors:ALab.Manual,Elsevier,NewYork,(1986)(ISBN0444904018)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,编辑.F.M.Ausubel等，J.WileyPress(2006)，其公开的内容通过引用并入本文。相应地，能获得本发明的融合蛋白，其通过转化载体(其包括编码融合蛋白的多核苷酸序列)到宿主细胞中，培养宿主细胞使得多肽(其被多核苷酸编码)被表达并且从宿主细胞回收多肽，或者在分泌信号附加到蛋白质的情况下在周围的培养基中回收。用于产生本发明的融合蛋白的、关于适合的宿主细胞的进一步的详细内容在下文提供。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物。用于转化的适合的原核宿主细胞包括例如，大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，以及在假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种其他种类。在原核宿主细胞中例如大肠杆菌，多肽可包括N-末端甲硫氨酸(met)残基，以促进在原核宿主细胞中重组多肽的表达。N-末端Met可以从所表达的重组多肽中切除。在原核宿主细胞中使用的表达载体通常包括一种或多种表型上可选择的才示i己基因(phenotypicselectablemarkergene)。表型上可选择的才示i己基因例如是，编码赋予抗生素抗性的蛋白质的基因或编码提供自养需求的蛋白质的基因。编码本发明的多肽免疫结合物的DNA,可以克隆到框架内普通的细菌表达载体的多个克隆位点。理想地，所述载体含有在克隆位点上游的可诱导的启动子，以使诱导物的加入导致在期望时间产生高水平的重组蛋白。关于重组蛋白的表达，细菌细胞在生长培养基中繁殖，直到达到预定的吸光度。然后诱导重组蛋白的表达。然后进行纯化和再折叠，其使用本领域技术人员广泛知晓的技术。也可使用哺乳动物细胞或昆虫宿主细胞培养系统表达重组多肽。这些系统具有的优点是，其产生的多肽会经受翻译后修饰例如糖基化，并且当其4皮施用时其可产生蛋白质的更高的生物稳定性。关于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统对于本领域技术人员是广泛知晓的。此外，也已知建立了哺乳动物来源的细胞系，例如猴肾细胞的COS-7细胞系和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。描述了关于引入DNA到哺乳动物细胞的已建立的方法。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列能从病毒基因组切除。也可以使用另外的控制序列，其显示改善了哺乳动物表达载体中外源基因的表达。本发明的融合蛋白可进一步在酵母宿主细胞中表达，优选地从酵母菌属(例如啤酒酵母)，Hansuela或毕赤酵母属，或者在其他的真菌表达系统例如曲霉中表达。酵母转化方案对于本领域技术人员是已知的。一个这样的方案在Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929,1978.中描述。35关于宿主细胞的任何类型对于本领域技术人员是已知的，纯化重组多肽或片段的方法会不同，其根据因素例如所使用的宿主细胞的类型，以及是否重组多肽或片段^皮分泌到培养基中。通过测定其"同一性百分比"能对比两种或多种多核苷酸序列。同样地，通过测定其"同一性百分比"能对比两种或多种多肽序列。两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，可以通过为最佳对比目的而进行的序列比对(例如为了序列的最佳比对，在第一个序列中引入间隙)来测定，和可以通过对比在相应位置的氨基酸残基或核苷酸来测定。"最佳的比对"是形成最高同一性百分比的两种序列的序列比对。通过在^皮对比的序列中同一性氨基酸残基或核苷酸的数量，确定同一性百分比(即同一性％=同一性位置的数量/位置的总数量x100)。本发明进一步延伸至依照本发明的融合蛋白，其中的结合Fc受体的蛋白含有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDN0:1或2的氨基酸序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、或至少98%同一性、至少99%同一性、至少99.5%同一性或者至少99.9%同一性。通常所述同源性序列显示多肽的生物功能，所述多肽具有SEQIDNO:l或2的氨基酸序列。使用本领域技术人员已知的数学算法能完成两种序列间的同一性百分比的测定。NBLAST和XBLAST程序是执行这种算法的计算机程序的例子。核苷酸BLAST搜索能以NBLAST程序进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。蛋白质BLAST搜索能以XBLAST程序进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了对比目的能利用GappedBLAST以获得带间隙的序列比对。可选择地，能使用PSI-Blast进行迭代搜索，其检测分子间的远缘关系(distantrelationship)(Idem.)。在使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序情况下，能使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参阅URLhttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。能利用进一步的适合的基于计算机的算法程序，并且其对于本领域技术人员是已知的。由于遗传密码已知的简并性，其中多于一种密码子能够编码相同的氨基酸，编码本发明的融合蛋白或多肽组分的多核苦酸序列可在其序列中产生变化，并且仍然编码具有相同氨基酸序列的多肽，如未改变的多核苷酸序列编码的一样。这种变体DNA序列能从同义突变产生(例如发生在PCR扩增期间)，或者能是天然序列准确诱变(deliberatemutagenesis)的产物。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子还包括与天然序列具有至少80%同一性的核香酸序列，所述天然序列编码本发明的融合蛋白或其多肽组分，例如含有SEQIDNO:l或2的氨基酸结合序列的、结合Fc受体的多肽。同样包括一些实施方式，其中的核苷酸分子包括与融合蛋白或多肽组分具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或至少99.9%同一性的序列。除非另有说明，本文使用的所有的技术和科学术语，在本发明的
技术领域：
中通常具有可被本领域技术人员理解的含义。贯穿本发明说明书，除非上下文另有说明，术语"包括(comprise)"或"包含(include)，，或者变体例如'包含(comprises)，或'含有(comprising)'，'包括(includes)，或'包含(including)，可理解为，指含有陈述的整体或者整体的组，但不排除任何其他的整体或整体的组。除非上下文清楚地另有说明，如本文使用的术语"一种(a)"、"一个(an)"和"所述(the)"包括单数和复数。因此，例如，所提及的"一种活性剂"或"一种药学上的活性剂"包括一种活性剂以及二种或更多的不同的活性剂的组合，以及当提及"一种载体"时，其包括二种或更多的载体的混合物，也包括一种载体，等等。用以描述本发明的融合蛋白的多肽组分的命名，按照常规惯例进行，其中在每个氨基酸残基中氨基(N)出现在左端，羧基在右端。如使用于本文的表述"氨基酸"预期包括天然的和合成的氨基酸，以及D和L氨基酸。合成的氨基酸还包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐以及tt酸衍生物例如酰胺。存在于本发明多肽内的氨基酸能被曱基化、酰胺化和乙酰化修饰，或者能用其他的化学基团取代，所述化学基团能改变循环半衰期而无不利地影响其生物活性。本文使用的术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"可互换地描述了一系列的至少二个氨基酸，其通过肽键或修饰的肽键例如电子等排体共价连接。氨基酸的最大数量没有设置限制，其可包括肽或蛋白质。术语"寡聚体"和"寡肽"也预期用来指本文描述的肽。此外，术语多肽延伸至肽的片段、类似物和衍生物，其中所迷片段、类似物或衍生物保持了和该片段、类似物或衍生物衍生来源的肽相同的生物功能活性。此外如本文使用的术语"融合蛋白"也能用来指融合多肽、融合肽或类似物，或者也可以指免疫结合物。术语"融合蛋白，，指一种分子，其中二种或更多的亚基分子(通常是多肽)被共价或非共价的连接。如本文使用的术语"治疗有效量"指本发明融合蛋白降低下述疾病严重程度和/或緩解下述疾病所需的量病原性疾病、癌性病症、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神经变性疾病或其至少一种症状；或者用于预防下述疾病的发展所需的量病原性疾病、癌性病症、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神经变性疾病或一种或多种与其相关的症状。如本文使用的术语"预防有效量"涉及组合物的量，所述量是用于在施用本发明的化合物后，在受治疗者中预防下述疾病的初发、发展或复发所需的量病原性疾病、癌性病症、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神经变性疾病或其至少一种症状。如本文4吏用的术语"治疗(treatment)"和相关的术语例如"治疗(treat)"和"疗法(treating)，，指减弱下述疾病的发展、严重度和/或持续时间，或改善其至少一种症状病原性疾病、癌性病症、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神经变性疾病，其中所述减少或改善是施用本发明融合蛋白的结果。术语"治疗"因此指能有益于受治疗者的任何方案。治疗可以是关于现有病症或可以是预防性的(预防治疗)。治疗可以包括治愈、緩解或预防效果。本文涉及的"治疗性"和"预防性"治疗要考虑其最广泛的范围。术语"治疗性"不是必须指受治疗者被治疗到完全康复。相似地，"预防性，，不是必须指受治疗者最终不会感染疾病病症。如本文使用的术语"受治疗者"指动物，优选哺乳动物并且尤其是人。在一个特定的实施方式中，受治疗者是哺乳动物尤其是人，其已经或将要暴露于放射，例如放射治疗例如化学疗法或放射疗法。术语"受治疗者"与如本文使用的术语"患者"可互换。如本文定义的融合蛋白或多肽的片段通常指一段序列，其包括至少5至7个连续的氨基酸，经常包括至少约7至9个连续的氨基酸，通常包括至少约9至13个连续的氣基酸，更优选包括至少约20至30或更多连续的氨基酸，并且最优选包括至少约30至40或更多连续的氨基酸。如本文定义的多肽的"衍生物"或"变体"，例如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3或定义本发明融合蛋白的那些，指通过改变多肽的氨基酸序列而修饰的多肽，例如通过操纵编码多肽的核酸或通过改变多肽自身。天然氨基酸序列的这种衍生物可以包括插入、添力口、缺失和/或置换一个或多个氨基酸，优选地同时提供具有千扰素a结合活性的肽。通常这种衍生物包括插入、添加、缺失和/或置换25个或更少的氨基酸，更优选15个或更少，甚至更优选10个或更少，仍旧更优选4个或更少并且最优选仅1个或2个氨基酸。如广泛理解的是，氨基酸水平的同源性通常是指氨基酸的相似性或同一性。相似性允许'保守性变异，，例如置换一个疏水性残基，例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或曱硫氨酸置换另一残基，或者用一个极性残基置换另一残基，例如用赖氨酸和谷氨酸置换天冬氨酸，或者用谷氨酰胺置换天冬酰胺。在本发明的范围内进一步提供非模拟肽(Non-peptidemimetic)。相应地，变体与未改变的多肽序列相比优选具有至少80%同一性，最优选至少90%同一性的氨基酸序列。例如通过使用GAP计算机程序(6.0版)对比序列信息，可以测定同一性百分比，所述GAP计算机程序由Devereux等.(Nucl.AcidsRes.12:387,1984)描述，并且能从UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG)获得。在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的结合Fc受体的多肽的衍生物，能结合FcR并且足以诱导其内陷。如果需要纯化多肽，融合蛋白可以进一步含有Fc结构域的结合A蛋白和G蛋白的区域，或者结合其他配体的序列，例如His-标记或GST-标记。参照下述实施例现在描述本发明，实施例的提供是为了说明的目的，39而不是预期不当地限制本发明。实施例实施例1-免疫结合物的产生对于含有流感病毒血球凝集素(HA)作为抗原性片段的、免疫结合物(融合蛋白)的产生，HA基因从病毒标准品(viralstandard)中使用PCR扩增，并且克隆到含有Fc基因片段的适合的表达载体作为融合蛋白，所述病毒标准品从NationalInstituteofBiologicalStandardsandControl,PottersBar(NIBSC)中获得。在puc-基础的载体pAcVSVTMSfi中扩增后，HA3基因的夕卜部区域使用正向引物5'-GCGCGGCCATTATGGCCCAAAACCTTCCCGGAAATG-3'和反向引物5'-GCGCGGCCGAGGCGGCCCCAGTCTTTGTATCCTGAC-3'，从A/Bangkok/1/79(BK79)扩增并且纯化扩增的片段，以Sfi(下划线位点)切割并且克隆到Fc融合蛋白载体pAc3cFcHis，其含有人IgGlFc结构域(SDChappie和IMJonesJ.Biotech.(2002)第95巻，第269-27页和YaoYY.JInfectDisease(2004)第190巻，第91-98页)。免疫结合物因此含有BK79HA3的第17至第530位氨基酸和人IgGlC2/3区域，并且通过最后质粒的测序复检。通过构建重组的杆状病毒在昆虫细胞中表达融合蛋白，其是使用质粒共转染的快速重组方法，所述质粒含有线性杆状病毒AcMNPVDNA(YaoYYJ.Infect.Disease(2004)第190巻，第91-98页)。重组的杆状病毒在多孔板的Sf9细胞上被滴定，并且在静置培养中使用无血清昆虫表达培养基(Invitrogen)大量制备。来自这些静置培养物的免疫结合物(融合蛋白)也用于检测蛋白的表达以及FcR的结合和内陷，其是使用HA抗血清的免疫组化染色进行，所述HA抗血清得自NIBSC。可选择地，也可使用商业的BAC墨TO陽BAC系统(Invitrogen)。使用5LWaveBioreactor容器(www.wavebiotech.com)，免疫结合物在HIGHFIVEtm或Sf9细胞中表达，并且纯化用于制备关于效力试验的疫苗，纯化使用标准的亲合层析方法和层析柱(GEHealthcare,UK)。相似地，含有HA(得自H5禽流感病毒A/Vietnam/1194/04)的免疫结合物通过下述过程产生使用下述正向引物5'誦GCGCGGCCATTATGGCCAAGATCAGATTTGCATTGG-3'和反向引物5'國GCGCGGCCGAGGCGGCCTTGGTAAATTCCTATTG-3'PCR扩增外部区域，并且克隆到FcR载体用于大量制备，其是通过上文描述的Sf9细胞中杆状病毒的表达。免疫结合物含有H5HA的第17至第530位的氨基酸和人IgGlC2/3区域，并且通过最后质粒的测序复检。使用合成的基因构建体也可产生免疫结合物。这种方法有额外的优点，其可引入期望的基因改变，例如除去蛋白酶切割位点或者流感病毒HA或HIVgpl20基因的可变环，或者产生异源融合抗原例如Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196TB基因融合体。此外合成的基因被用于产生结合FcR的突变体，其通过在Fc结构域内的序列改变实现，例如用缬氨酸残基和丙氨酸残基分别替代在234和235位的两个亮氨酸残基。实施例2-结合和内陷的筛选通过其结合并且诱导FcR内陷的能力进一步选择免疫结合物。使用商业上的血液DC-纯化试剂盒(MiltenyiBiotec)从外周血分离表达CD32和CD64的树突状细胞(DC)。在补充有2%胎牛血清的RPMI中室温下孵育免疫结合物和DC15-30分钟。细胞在0.1%的戊二醛中固定并且使用0.3-0.5%的非离子型去污剂例如TritonxlOO或NonidetP40渗透，并且通过免疫荧光显像免疫结合物，其是使用抗适当HA分子的兔抗血清然后使用第二层FITC-标记的羊抗-兔实现。通过流式细胞仪(FACS分析)评估结合，其是使用THP-1细胞观察与人Fc受体的结合，以及用RAW细胞(小鼠树突状细胞)确认与小鼠FcR的结合，并且确保关于免疫原性研究的动物模型的有效性。用Nikon共聚焦显微镜通过观察细胞内嚢泡(vesicle)评估内陷。获得的数据的说明显示在图2、3和4中，其证明了区分两种Fc变体免疫结合物的能力，所述Fc变体免疫结合物使用RAW和THP-1细胞以实施例1详述方式产生，并且LL变体显示FcR的结合，而VA变体不结合FcR或者不引起FcR的内陷。具体地，图2显示人THP-1上的Fc受体与融合蛋白结合的、FACS示踪说明。中心的(中间的)峰涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括作为抗原性肽的得自流感病毒的血球凝集素，如实施例1所描述，以及包括结合Fc受体的区域，其中结合Fc的多肽区域(未改变时包括SEQIDNO:1的氨基酸序列)的氨基酸序列被突变而形成变体("LL"变体)，其中在234和235位存在的两个亮氨酸残基被缬氨酸和丙氨酸替代。所述峰说明这种变体融合蛋白没有结合存在于THP-1细胞上的Fc受体。图2中显示的3个峰中最右侧的峰显示结合了依照本发明的融合蛋白，所述融合蛋白包括血球凝集素抗原性多肽和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。这个峰的位置说明，这种融合蛋白与存在于THP-1细胞上的Fc受体结合。图3显示上文描述的2种融合蛋白与RAW细胞上存在的Fc受体的结合。变体融合蛋白的结合由中间的峰说明，这显示没有变体融合蛋白的结合(具有亮氨酸置换，其存在于结合Fc受体的多肽的序列内)。由未突变融合蛋白介导的结合由右侧的峰说明，这确认了融合蛋白没有结合到存在于鼠RAW细胞上的Fc受体。图4显示替代的融合蛋白与人THP-1细胞上存在的Fc受体的结合。图4左侧的峰涉及变体融合蛋白的结合，所述变体融合蛋白包括得自HIVgpl20的抗原性多肽，而且进一步其中的结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列，如上文所描述所迷氨基酸序列经过双亮氨酸突变。这个峰的位置显示，没有发生Fc受体与这种变体的结合。右侧的峰涉及融合蛋白，其包括得自HIVgpl20的抗原性多肽和结合Fc受体的多肽，所迷结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。这个峰的位置说明，这种融合蛋白结合到存在于THP-1细胞中的Fc受体。实施例3-针对异源性病毒的保护作用(遗传突变产生的病毒序列的漂移)HA3(得自A/Bangkok/1/79病毒)耦合到Fc结构域(得自IgGl)的免疫结合物用于免疫balbc鼠，所述balbc鼠然后用异源性病毒A/Victoria/75(H3N2)攻击，A/Victoria/75(H3N2)含有林突变，所述林突变从疫苗林产生3种漂移分离事件(drifteventseparation)。使用雏鸡和火鸡红细胞，测定免疫动物中抗血清诱导的、血球凝集素抑制(HAI)的滴定度。免疫结合物疫苗防止体重减轻和降低肺中病毒载量的能力用于评估免疫动物中保护作用的水平。动物在第0、13和27天用5ug的免疫结合物(不含任何佐剂)接种疫苗，并且在第41天用非致死剂量的感染性外源病毒攻击。免疫的动物显示了体重减轻的显著下降(图1)并且肺中病毒滴定度下降到1/3(3-foldreduction)，这显示免疫结合物疫苗保护动物对抗异源病毒的病毒感染。含有VA变体的免疫结合物显示无保护作用，即是观察到肺中的病毒滴定度没有下降。然而，显示免疫动物攻击前或攻击后均没有检测到HAI滴定度，即使在使用火鸡红细胞改善HAI灵敏度情况下。这些结果尤其令人惊奇，因为HAI滴定度被广泛认为对于保护作用具有指示性，并且HAI滴定度的诱导事实上是用于批准年度性流感疫苗(annualinfluenzavaccine)的主要标准之一。因此显现了，Fc-免疫结合物诱导细胞免疫应答的能力足以产生针对流感病毒的保护，即使在缺乏强的体液免疫应答的情况下。由本发明免疫结合物激发的免疫甚至更令人惊奇，因为它不仅在对抗异源林(其具有3种漂移分离事件(drifteventsapart))中给予保护，而且在年度性流感疫苗中的同源林方面，当施用常用剂量的三分之一时它能起相同作用，激发出针对同源林的保护作用。实施例4-针对广泛流行病毒(禽流感)的保护作用HA5(得自A/Vietnam/1194/2004(H5N1)禽流感病毒)耦合到Fc结构域(得自IgGl)的免疫结合物用于免疫balbc鼠，所述balbc鼠然后用同源病毒攻击，所述同源病毒含有A/Vietnam/1194/2004HA5与PR8病毒(NIBRG-14)的基因纟且合。对这种鼠模型先前的工作已显示，HA5亚基疫苗在对抗感染中，除非使用高剂量并且在佐剂存在下才有保护作用。使用雏鸡红细胞测定免疫动物中抗血清诱导的、血球凝集素抑制(HAI)的滴定度。免疫结合物疫苗防止体重减轻和降低肺中病毒载量的能力用于评估免疫动物中保护作用的水平。动物在第0、14和28天用15ug的免疫结合物(不含任何佐剂)接种疫苗，并且在第43天用致死剂量的感染性病毒攻击，所述感染性病毒携带得自禽流感广泛流行;昧的H5基因。免疫的动物显示了对抗感染的显著的保护作用，具有67%的存活率并且免疫动物的肺中病毒滴定度显著下降，包括在一些存活动物中没有可^r测的病毒。此外，在攻击前免疫动物显示检测不到HAI滴定度，^旦在病毒攻击后免疫动物确实显示针对H5的HAI滴定度，虽然其低于批准的年度性流感疫苗所要求的滴定度的4倍增加。因此显现了，Fc免疫结合物诱导细胞免疫应答的能力足以产生针对禽流感的保护，并且使用快速重组DNA技术产生免疫结合物，在对抗突然出现的广泛流行病毒的疫苗的生产中，应具有特殊效用。所有涉及本发明说明书的文献通过引用并入本文。对于本发明描述的实施方式的各种修改和变化，对于本领域技术人员是明显可知的，不脱离本发明的范围。尽管本发明已联系特定优选的实施方式进行描述，也应理解如权利要求所述，本发明不应不当地受限于这些特定实施方式。实际上，执行本发明所描述方式的各种修改方案(其对于本领域技术人员是明显可知的)都预期包括在本发明中。权利要求1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述结合Fc受体的多肽得自恒定区，所述恒定区得自IgG亚型的人免疫球蛋白的重链。3.根据权利要求1或权利要求2所述的融合蛋白，其中Fc受体多肽包括人IgG免疫球蛋白CH2恒定区或者其片段，所述片段与所述CH2恒定区显示相同生物功能。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述人IgG免疫球蛋白是IgGl或lgG3。5.根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中所述CH2序列在等同于人IgG免疫球蛋白重链恒定区CH2序列第297位残基含有天冬酰胺残基。6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:1的氣基酸序列。7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述结合Fc受体的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。8.根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中所述结合Fc受体的多肽以从约10《Kd至约10一Kd的解离速率常数结合Fc受体。9.根据权利要求1至7任一项所述的融合蛋白，其中所述结合Fc受体的多肽以从约lxl06Ka至约3xl09Ka的结合速率常数结合Fc受体。10.根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中所述Fc受体多肽和所述抗原性多肽通过共价键方式连接。11.根据权利要求1至9任一项所述的融合蛋白，其中所述Fc受体多肽和所述抗原性多肽通过非共价《睫方式连接。12.根据权利要求1至9任一项所述的融合蛋白，其中所述Fc受体多肽和所述抗原性多肽通过连接体部分或间隔区序列的方式连接。13.根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中所迷抗原性多肽序列选自由病毒多肽、细菌多肽、真菌多肽和得自寄生虫的多肽组成的组。14.根据权利要求1至12任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原性多狀得自非病原性疾病，所述非病原性疾病选自由肿瘤特异抗原、自身免疫性疾病和神经变性疾病组成的组。15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述多肽是病毒多肽，并且所述病毒是HIV、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述多肽是病毒多肽，并且所述病毒是A型流感病毒。17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述A型流感病毒选自由H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7组成的组。18.根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其进一步包括一种或多种另外的异源多肽。19.一种免疫原性组合物，其包括依照权利要求1至18任一项所述的融合蛋白。20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，其进一步包括至少一种佐剂。21.—种在受治疗者中诱导免疫应答的方法，其包括以下步骤以足以引起免疫应答的量、向受治疗者施用权利要求19或权利要求20所述的免疫原性组合物。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述免疫应答是细胞毒性T细胞(CTL)应答。23.—种多核苷酸序列，其编码权利要求1至18中任一项所述的融合蛋白。24.—种载体，其包括权利要求23所述的多核苷酸序列。25.根据权利要求24所述的载体，其进一步包括至少一种控制序列元件，所述控制序列元件可操作地连接到所述多核苷酸序列。26.—种宿主细胞，其包括权利要求24或25所述的载体，或者权利要求23所述的多核苷酸序列。27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由BHK、VERO、HT1080、293、COS和CHO组成的组。29.—种在受治疗者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤-提供依照权利要求1至18任一项所述的融合蛋白，以及-向受治疗者施用治疗有效量的所述融合蛋白，在所述受治疗者中期望得到针对所述融合蛋白中提供的所述抗原性多肽或其片段而诱导的免疫应答。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法延伸至为治疗病原性疾病感染而诱导免疫应答，所述方法进一步包括以下步骤-获得源自病原体的抗原性多肽序列，其是所述疾病的成因或者是得自所述病原体的产物，-使用所述抗原性多肽序列以形成所述融合蛋白，以及-向需要所述治疗的受治疗者施用治疗有效量或预防有效量的、含有所述融合蛋白的组合物。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗原性多肽得自细菌病原体或病毒病原体。32.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法进一步延伸至为治疗非病原性疾病病症而诱导免疫应答，所述方法进一步包括以下步骤-获得对于所述非病原性疾病病症特异性的抗原性多肽序列，-使用所述抗原性多肽序列以形成所述融合蛋白，以及_向需要所述治疗的受治疗者施用治疗有效量或预防有效量的、含有所述融合蛋白的组合物。33.根据权利要求32所述的方法，其中非病原性抗原性多肽选自由肿瘤特异性多肽、对于神经变性疾病具有特异性的多肽和对于自身免疫性疾病具有特异性的多肽组成的组。34.根据权利要求29至33任一项所述的方法，其中所述免疫应答是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。35.根据权利要求29至34任一项所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物是人。37.—种在受治疗者中产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的方法，其包括以下步骤在允许在受治疗者中产生CTL应答的条件下，向受治疗者施用依照权利要求19或权利要求20所述的免疫原性组合物。38.—种在受治疗者中产生免疫应答的方法，其包括在允许表达所述多核苷酸并且产生所述融合蛋白的条件下，向受治疗者的细胞施用依照权利要求23所述的多核香酸或依照权利要求25所述的载体，从而激发对于所述融合蛋白的免疫应答。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体是病毒载体。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。43.根据权利要求38至42任一项所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述哺乳动物是人。45.根据权利要求38至44任一项所述的方法，其中所述多核香酸或载体通过静脉内或肌内施用。46.—种用于诱导免疫应答的药物组合物，其中所述药物组合物包括融合蛋白连同药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，其中所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。47.—种用作药物的融合蛋白，其包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。48.融合蛋白用于制备治疗或预防疾病的药物的用途，所述融合蛋白包括一种或多种抗原性多肽序列和结合Fc受体的多肽，其中所述结合Fc受体的多肽以足以引起所结合Fc受体内陷的结合亲合力来结合Fc受体。49.根据权利要求48所述的用途，其中所述疾病是病原性疾病。50.根据权利要求49所述的用途，其中所述病原性疾病是病毒感染。51.根据权利要求50所述的用途，其中所述病毒感染是HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或A型流感病毒感染。52.根据权利要求51所述的用途，其中所述A型流感病毒选自下列亚型H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7。53.根据权利要求48所述的用途，其中所述疾病是非病原性疾病。54.根据权利要求53所述的用途，其中所述非病原性疾病选自由癌性或恶性病症、神经变性疾病和自身免疫性疾病组成的组。全文摘要本发明提供了包含结合Fc受体的多肽和抗原性多肽的融合蛋白。所述融合蛋白可以进一步包括连接到结合Fc受体的多肽和抗原性多肽的、连接体序列或铰链区。结合Fc受体的多肽通常包括人IgG免疫球蛋白CH2恒定区。抗原性多肽能是诱导免疫应答的任何多肽。向受治疗者施用所述融合蛋白，结果诱导针对所述融合蛋白中提供的抗原性多肽的、细胞毒性T淋巴细胞应答。本发明进一步延伸到使用本发明所述的融合蛋白治疗受治疗者中疾病病症的方法。文档编号C07K16/00GK101448854SQ200780018518公开日2009年6月3日申请日期2007年3月22日优先权日2006年3月22日发明者卡米洛·科拉科申请人:免疫生物学有限公司