改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：1)制备柔性载体：包括将聚丙烯腈树脂微球利用四乙烯五胺进行改性，得改性后的聚丙烯腈柔性载体；2)载体的活化：包括将改性后的聚丙烯腈柔性载体先用磷酸缓冲液浸泡，然后利用戊二醛进行交联反应；得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；3)制备固定化木瓜蛋白酶：包括将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体与木瓜蛋白酶进行固定化反应，最终得固定化木瓜蛋白酶。本发明的方法克服了现有技术所合成的载体在酶固定化过程中，由于刚性碰撞造成的酶活力损失，同时又可最大限度地保留游离酶的均相催化活性，从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。
【专利说明】改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化酶的制备方法，具体涉及一种利用改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，属于酶固定化【技术领域】。
【背景技术】
[0002]木瓜蛋白酶作为生物催化剂的重要成员之一，在食品、日化、医药等领域有广泛的应用。尽管木瓜蛋白酶具有优良的催化性能，但直接使用游离酶作为生物催化时，不仅回收率低，操作稳定性差，且无法实现重复利用，这就造成了酶的浪费，增加了成本，也使应用受到了一定的限制。酶的固定化技术则能够较好的解决上述问题。固定化木瓜蛋白酶的核心在于合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法。然而在利用各类载体对木瓜蛋白酶进行固定化的过程中，人们逐渐发现传统的酶固定化方法虽然有很多的优点，但都有各自的不足。如包埋法中载体对大分子底物和产物扩散的限制；交联法中酶的不可再生；物理吸附法和离子结合法中酶易于从载体上脱落等。而由共价结合法制备的固定化酶与载体结合稳定，不易脱落，可以长期使用，因此克服了上述固定化方法中的一些不足，但该法的主要不足就在于固定化时常采用较激烈的条件，以牢固的共价键形式将酶固定在载体上，因而使酶活损失较大。为此人们期望通过对共价结合法进行改进。
[0003]现有的酶固定化方法主要有如下几种:
[0004]1.曲伟光等人利用聚合接枝法，合成了一种具有亲水性的环氧聚合物柔性载体:PS-acyl-P (AM-CO-GMA)，并成功用于柔性共价固定化脂肪酶。结果表明，所得固定化酶的热稳定性、操作稳定性和 对有机溶剂的耐受性均有提高。但该载体不仅合成步骤繁琐且稳定性较差。
[0005]2.魏荣卿等人采用壳聚糖为载体，选用双醛淀粉作为改性功能基，柔性固定化木瓜蛋白酶，结果表明，所得固定化酶活回收率明显提高了。但由于双醛淀粉具有氧化度不均一、水溶性较差的缺点，不仅反应速度慢，而且严重影响酶的固定化的效果，进而影响酶的固定化性质。
[0006]3.选用聚苯乙烯系大孔树脂作为酶固定化载体，通过接枝改性的方法来改善载体的亲水性，用来固定化酶，但这类材料在合成过程中使用了氯甲醚，改性原理属于加成反应，在改性过程中有氯化氢生成，因此原子利用率不高，对环境也不友好。
【发明内容】
[0007]本发明需要解决的技术问题是提供一种利用柔性载体制备固定化木瓜蛋白酶的方法，采用本发明的方法能解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤:
[0009]I)、制备柔性载体，依次进行以下步骤:
[0010]①、聚丙烯腈树脂改性:[0011]将聚丙烯腈树脂微球加入至反应溶剂中浸泡20~28h，从而使聚丙烯腈树脂微球充分溶胀；然后加入作为亲水性柔性基团的四乙烯五胺(TEPA)，作为催化剂的NaOH，所述聚丙烯腈树脂微球:四乙烯五胺(TEPA) =NaOH的重量比为1: 11~12:0.1~0.2 ;在氮气保护下于70°C~90°C、以150~200r/min的转速搅拌反应9~11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球；
[0012]②、改性后的聚丙烯腈树脂微球用反应溶剂浸泡洗涤至洗涤液为无色，再依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤(数次)，然后用去离子水洗涤，接着依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗,40~60°C下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)；
[0013]2)、载体的活化:
[0014]取Ig改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)，用8~12ml (较佳为1mL)的pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液浸泡20~28h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA ；
[0015]在浸泡后PAN-TEPA中加入体积浓度为2%~6%的戊二醛8~12ml (较佳为1mL)，于20~30°C (较佳为25°C )交联反应7~9h时后，过滤，所得滤饼依次用去离子水、pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液洗涤后，于40~60°C下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；
[0016]3)、制备固定化木瓜蛋白酶:
[0017]将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体浸泡在8~12ml (较佳为1mL)的pH为6.5~
8.5的磷酸缓冲液的锥形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为:0.06~0.10:1，于25~35°C (固定化温度)恒温振荡2~4h后，过滤分离；
[0018]所得滤饼用pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液进行反复冲洗(8~10次)后，于36~380C (较佳为37°C )的真空干燥器中干燥4.5~5.5h(较佳为5h)后,得固定化木瓜蛋白酶。于冰箱中保存(4°C )即可。
[0019]作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的改进:
[0020]所述步骤I)中的反应溶剂为乙二醇(ED)。
[0021]作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进:
[0022]所述步骤①:加入四乙烯五胺(TEPA)和NaOH后，接通氮气，在氮气保护下先以150~200rpm的搅拌速度在20~30°C的常温下搅拌1.5~2.5h ;然后继续在氮气保护下于70°C~90°C、以150~200r/min的转速搅拌反应9~11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球。
[0023]作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进:所述pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液具体为0.lmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)。
[0024]作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进:所述步骤①每Ig聚丙烯腈树脂微球(PAN)配用250~350mL的反应溶剂。
[0025]本发明的制备柔性载体的过程中，载体以大孔交联聚丙烯腈微球(即，聚丙烯腈系共聚体、聚丙烯腈树脂微球)为母体，通过化学改性的方式将亲水性四乙烯五胺引入母体中，制得一种聚丙烯腈柔性载体。本发明所用的柔性链为四乙烯五胺属多胺类化合物。
[0026] 在本发明中:[0027]聚丙烯腈树脂微球选用D - 160型大孔吸附树脂，交联度7 % DVB,含氮量
22.18%，功能基含量:15.83CN mmol/g ;例如可购自中蓝晨光化工研究院。
[0028]步骤(1)的聚丙烯腈树脂改性中的“依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗”为常规操作方式，即为:将前一步骤的所得物先进行碱洗(放入浓度为lmol/L的NaOH溶液中浸泡I~3小时)；然后水洗至洗涤液为中性；再进行酸洗(将水洗后的所得物放入浓度为Imol/L的HCl溶液中浸泡I~3小时)；然后水洗至洗涤液为中性。
[0029]本发明所采用的测定方法具体如下:
[0030]样品中酶含量的测定:取适量样品待测液，在278nm处用紫外可见分光光度计测
其吸光度，通过标准曲线，确定待测液中酶蛋白的浓度。根据下式计算酶的固载量Qe:
【权利要求】
1.改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是包括以下步骤: 1)、制备柔性载体，依次进行以下步骤: ①、聚丙烯腈树脂改性: 将聚丙烯腈树脂微球加入至反应溶剂中浸泡20~28h，从而使聚丙烯腈树脂微球充分溶胀；然后加入作为亲水性柔性基团的四乙烯五胺，作为催化剂的NaOH，所述聚丙烯腈树脂微球:四乙烯五胺=NaOH的重量比为1: 11~12:0.1~0.2 ;在氮气保护下于70°C~90°C、以150~200r/min的转速搅拌反应9~11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球； ②、改性后的聚丙烯腈树脂微球用反应溶剂浸泡洗涤至洗涤液为无色，再依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤，然后用去离子水洗涤，接着依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗，40~60°C下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性载体； 2)、载体的活化: 取Ig改性后的聚丙烯腈柔性载体，用8~12ml的pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液浸泡20~28h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA ； 在浸泡后PAN-TEPA中加入体积浓度为2 V0~6%的戊二醛8~12ml，于20~30°C交联反应7~9h时后，过滤，所得滤饼依次用去离子水、pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液洗涤后，于40~60°C下真 空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体； 3)、制备固定化木瓜蛋白酶: 将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体浸泡在8~12ml的pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液的锥形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为:0.06~0.10:1，于25~35°C恒温振荡2~4h后，过滤分离； 所得滤饼用pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液进行反复冲洗后，于36~38°C的真空干燥器中干燥4.5~5.5h后,得固定化木瓜蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述步骤I)中的反应溶剂为乙二醇。
3.根据权利要求2所述的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述步骤①:加入四乙烯五胺和NaOH后，接通氮气，在氮气保护下先以150~200rpm的搅拌速度在20~30°C的常温下搅拌1.5~2.5h ;然后继续在氮气保护下于70°C~90°C、以150~200r/min的转速搅拌反应9~11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球。
4.根据权利要求1、2或3所述的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液为0.lmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是:所述步骤①中每Ig聚丙烯腈树脂微球配用250~350mL的反应溶剂。
6.根据权利要求5所述的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是:所述步骤I)中:聚丙烯腈树脂微球:四乙烯五胺=NaOH的重量比为I:11.89:0.12，所述步骤2)中:戊二醛的体积浓度为4%，交联反应温度为25°C ；所述步骤3)中:木瓜蛋白酶与戊二醛 活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为0.08~0.10:1。
【文档编号】C12N11/08GK104031903SQ201410259402
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】熊春华, 贾倩, 姚彩萍, 周苏果 申请人:浙江工商大学