专利名称：用于经典猪瘟的标记疫苗的制作方法
用于经典猪瘟的标记疫苗描述本发明涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。在本发明的一个实施方案中，这种标记疫苗的特征在于，编码TAV-表位的病毒核苷酸序列和/或TAV-表位的氨基酸序列包含与疾病相关性猪瘟病毒不同的序列，从而可以通过血清学和/或基因组分析方法，将显示疾病相关性猪瘟病毒感染的受试者与用本发明标记疫苗接种的受试者区分。发明背景
经典猪瘟(CSF)是在世界范围发生并且具有重大政治及经济意义的一种流行性动物疾病(Vand印utte和ChappuiS，1999)。经典猪瘟，也称作猪霍乱或猪瘟疫(pigplague)，是一旦在任何成员国中出现必须在欧盟层面以及向世界动物卫生组织(OIE)作出国际通报的疾病之一。经典猪瘟由黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的一种小的包膜RNA病毒引起。猪瘟病毒的天然宿主仅是家养和野生的猪物种(例如，欧洲野猪)。已经在欧盟内部尝试在不预防性接种情况下通过严厉措施根除CSF，自1990以来已经禁用预防性接种。尽管禁用，然而作为紧急接种，在猪瘟出现的情况下，接种仍代表法律批准的选项。在这种情况下中，接种应当通过紧急接种计划之一进行，这些计划已经由欧盟批准(见理事会指令第19号，2001/89/EC)。直至现在，罗马尼亚是已经实施过紧急接种的唯一国家。这种有限应用的原因在于当前可获得的标记疫苗的技术性约束，如疫苗效力限制，此外还有涉及常规接种动物的贸易壁垒(对国际销售的限制)。许可的标记疫苗的效率不能与显示明显优点的修饰的活疫苗相比，并且这些灭活疫苗或亚单位疫苗无论如何不适合用于紧急接种，原因在于免疫力发动较晚和需要再接种。考虑欧盟向东欧国家扩大和日益增加的全球化，已经讨论了用于潜在紧急接种的新策略，其将在避免大规模剔除动物和相关经济损失方面发挥重要作用的(Leifer等人，2009)。因此对于高度有效的疫苗存在迫切需要，这种疫苗允许在接种和未接种的动物之间进行血清学区分并且还显示传统修饰的活疫苗的全部优点。因为基于CSF病毒E2糖蛋白的第一代标记疫苗仅具有受限制的可获得性和严重缺点，如储存条件、成本、效力，所以对新的标记疫苗存在巨大需求。已经研究了这类疫苗的多种候选物，如DNA疫苗、免疫原性肽、载体疫苗、缺失突变体和嵌合猪瘟病毒(Beer等人，2007 ；Dong和Chen, 2007)。这些标记疫苗候选物的大部分显示以下缺点它们通过现代基因修饰方法产生。除复杂的准许程序之外，还由于顾客明显惧怕基因修饰的产品，基因修饰的疫苗显示明显的缺点。针对CSFV的传统疫苗包括修饰的活疫苗。这类疫苗在单次应用后是高度有效的，但是不允许基于血清学谱区分接种动物和感染动物。这些疫苗中的多种基于经典毒株“C”或其衍生物(所谓“C-株疫苗”)。另外，存在基于日本毒株“豚鼠兴奋阴性(GPE-)”、“Thiverval”株和“墨西哥PAV”株的疫苗，这些疫苗均已经在地区和国际环境下使用(Blome 等人，2006 ;Greiser_Wilke 和 Moennig, 2004 ；van Oirschot, 2003)。的确存在关于使用C-株疫苗的广泛数据。已知在应用这种疫苗4日后，可以显示动物受到抗强毒CSFV攻毒感染的完全保护。另外，接种后7日，在携带动物中提供免于攻毒病毒垂直传播的完全保护(de Smit 等人，2001)。已知的修饰活疫苗的明显缺点是完全不能血清学地区分接种动物和感染动物。有鉴于此，本发明的一项任务是提供一种能够区分接种动物和感染动物的修饰活疫苗。在标记疫苗领域，所谓的亚单位疫苗是现有技术已知的，这些亚单位疫苗基于CSFV的重组E2糖蛋白。这类疫苗的区分试验是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中针对Ems糖蛋白的抗体用来间接地检测CSF病毒感染。在目前，仅一种E2-亚单位疫苗是市场上可获得的，然而，许可证延迟了几个月(见EMA (欧洲药品管理局)关于E2亚单位疫苗的报道)。姑且不论不能销售这类产产品，这些系统显示严重的生物学缺点。一个这样的缺点是，在传递完全保护之前需要至少两次肠胃外免疫，这导致此类疫苗与以单次剂量用疫
苗饵料饲喂动物的“饵料接种法”完全不匹配。此外，紧急接种计划仅在多个实验中使用针对野生型CSFV的E2亚单位疫苗保护时，没有实现免遭垂直传播的完全保护的情况下才是合理的。这类系统的另一个缺点是，针对糖蛋白Ems的抗体用于血清学区分并且这类检验体系的灵敏度和特异性仅是略微中等的(Floegel-Niesmann，2003)。活的减毒CSF疫苗是本领域已知的，但是至今受困于多种缺点。现有技术中公开的大部分疫苗包含外来DNA并且使用基因工程方法(也称作重组DNA技术)产生，因此严重的环境风险评估问题伴随这种产品。已知其中从野生型TAV表位中置换或缺失氨基酸的其他CSFV变体(WO 2010/074575A2)。然而，在本发明中修饰的氨基酸残基和/或核苷酸在现有技术中既没有公开，有没有提示。多次传代也已经被用来产生可以用作疫苗的病毒变体，不过先前没有应用抗体压力。如现有技术中公开的旨在产生变体的病毒感染培养物的多次传代因此受到以下限制不得不实施大量培养物传代并且还无法控制将要修饰哪个表位(Hulst等人)。Kortekaas等人描述一种遗传稳定的、活的减毒CSF疫苗，所述疫苗能够血清学地将感染动物与接种动物区分。将突变的C-株使用定向方法进行基因修饰，由此使用重组DNA技术来将缺失引入CSFV的E2蛋白中。通过多次传代在病毒基因组内部的多个位置随后获得其他突变，以产生显示增殖增强的毒株。在Kortekaas等人中公开的毒株是基因修饰的病毒，考虑到用于释放基因修饰产物至环境中的复杂准许过程，这是一个明显缺点。Holinka等人公开了一种减毒的双抗原标记活CSFV毒株“FlagT4vn”，其中通过组合两个减毒遗传定子获得所述毒株。FlagT4v携带通过在El糖蛋白中19聚物插入所导入的阳性抗原标记(合成性Flag表位)和因突变E2糖蛋白中的单克隆抗体WH303(mAbWH303)表位的结合位点所产生的阴性标记。鼻内或肌内施用FlagT4v保护猪在接种后早期(2或3H )和晚期(28 H )时间免遭强毒CSFV Brescia株影响。FlagT4v在猪中诱导针对Flag表位强烈反应的抗体应答，但是不能抑制mAb WH303与代表WH303表位的合成肽结合。在Holinka中公开的疫苗涉及一种基因工程病毒，所述病毒在其基因组内显示外来DNA(除相关的载体序列和标记之外还有FLAG-标签序列)。与不显示外来或重组DNA的本发明相比，这表示一个明显缺点。文献WO 2007/143442A2描述了在CSFV E2的WH303表位内部突变的效果，所述突变将强毒Brescia CSFV的氨基酸序列逐步向BVDV毒株NADL的同源性氨基酸序列改变。在接种后第3日和21日用强毒Brescia病毒攻毒时，被病毒突变体感染的动物受到保护。在WH303表位内部这个位点处的修饰还导致开发区分接种动物与感染动物的诊断试验。即便存在这些效果，然而使用基因工程引入这些突变，因此将外来遗传物质导入病毒疫苗中。上述的现有技术公开了通过重组遗传技术被转基因而产生病毒毒株的疫苗。如上文所述，遗传学上转基因的疫苗遭遇环境安全性顾虑并且受困于复杂的准许方案和一般公众当中的恐惧，因此为它们的使用带来明显缺点。发明简述鉴于现有技术，作为本发明基础的技术问题是为家养猪和野生猪提供一种标记疫苗，所述标记疫苗提供免遭经典猪痕病毒影响的保护，能够区分接种动物和感染动物，优选地通过常规技术产生。在一个优选实施方案中，这种标记疫苗不通过重组基因修饰技术产生。这个问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提 供。本发明因此涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。在一个优选实施方案中，本发明还涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒，特征在于E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含与野生型经典猪瘟病毒不同的序列，由此所述病毒氨基酸序列显示以下置换的至少一种-氨基酸830的置换；丙氨酸至缬氨酸，-氨基酸833的置换；脯氨酸至丝氨酸，-氨基酸839的置换；谷氨酸至甘氨酸。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于修饰的病毒不通过重组DNA方法产生。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换-在核苷酸位置2862处的置换；T至C，-在核苷酸位置2870处的置换；G至A，-在核苷酸位置2889处的置换；G至A。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于病毒的氨基酸序列显示一种或多种以下置换-在蛋白质Eens中氨基酸426的置换；异亮氨酸至缬氨酸，-在蛋白质El中氨基酸576的置换；酪氨酸至组氨酸，-在蛋白质El中氨基酸583的置换；天冬氨酸至谷氨酸，-在蛋白质E2中氨基酸951的置换；苏氨酸至异亮氨酸。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换-在核苷酸位置1649处的置换；A至G，-在核苷酸位置2099处的置换；T至C，
-在核苷酸位置2122处的置换；T至G，-在核苷酸位置3225处的置换；C至T。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于TAV-表位的病毒氨基酸序列包含根据SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的序列。在一个优选实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO. I的序列。在另一个实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于，用如本文所述的疫苗治疗的受试者与被疾病相关性猪瘟病毒感染受试者，可以通过使用血清学和/或基因组分析方法分析从所述受试者获得的生物学样品来将区分。在另一个实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于基因组分析方法基于聚合酶 链反应(PCR)、优选地基于实时PCR，由此使用识别修饰的和/或疾病相关的病毒核苷酸序列的引物和/或探针。在另一个实施方案中，本发明的标记疫苗的特征在于血清学分析方法基于酶免疫测定(EIA)、优选地基于酶联免疫吸附测定(ELISA)，由此使用与修饰的和/或疾病相关的TAV-表位特异性结合的抗体。本发明的又一个方面涉及一种标记疫苗，优选地如本文所述的标记疫苗，其可通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的病毒逃逸突变体来获得。本发明的又一个方面涉及一种制造修饰的减毒活经典猪瘟病毒疫苗株、优选地如本文所述的疫苗株的方法，所述方法包括通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的逃逸突变体。在一个优选实施方案中，如本文所述的制造方法特征在于所述方法包括-在细胞培养下多次传代被疾病相关性猪瘟病毒感染的细胞，优选仔猪胚肾细胞，和-同时施加针对疾病相关性猪瘟病毒E2蛋白的TAV-表位的抗体和/或CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清。本发明还涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的标记疫苗连同可药用载体。本发明的又一个方面涉及如本文所述的标记疫苗，作为药物用于经典猪瘟的预防性治疗(接种)中，优选地通过肌内注射或口服施加。本发明的又一个方面涉及一种用于预防性治疗(接种)经典猪瘟的方法，所述方法包括将如本文所述的标记疫苗施用至、优选地通过肌内注射或口服施加至受试者，优选地是猪。经典猪瘟需要接种疫苗的另一个常见情况对应于在猪群中检测野毒感染。当猪的感染发生，以至于经典猪瘟病毒在野生猪或家养猪中存在时，需要对周围和/或相邻猪群紧急接种。随后在周围区域内对直至I岁至2岁全部猪(无论野生或家养)实施接种，目的是避免猪瘟病毒的暴发或大规模感染。本发明的标记疫苗理想地适用于猪瘟检测或暴发情况下的紧急接种。除注射之外，这种标记疫苗还便于通过口服途径快速和有效施用，并且允许区分被野毒(发热相关性)和疫苗感染的动物。发明详述本发明疫苗的开发不基于基因修饰方法，反而基于以下原理当置于选择性抗体压力下之时，病毒将以适应性方式自我修饰。本发明因此涉及非基因修饰的活疫苗，所述活疫苗提供对抗强毒CSFV的保护，显示全部标记疫苗的要求(血清学上和遗传上不同)。这种标记疫苗是通过施加选择性抗体压力至细胞培养下的不同C-株进行工程化制造。产生的变体优选地拥有在E2TAV表位中的3个氨基酸交换和在El蛋白中的两个补偿性交换。这些变体的稳定性通过在转瓶中多于10次细胞培养传代而得到证明，并且例如，肌内接种猪导致针对高度毒力的攻毒株的完全保护。另外，通过血清学和/或遗传技术，例如通过区分性免疫荧光染色和实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)系统，能够进行直接DIVA(differentiating infected from vaccinated animal,区分免疫和感染动物)。另外，通过优化商业E2-ELISA(例如通过改变临界值)或开发TAV特异性肽ELISA系统，间接DIVA可能是可实现的。因此，提出了一种针对CSFV的非基因修饰的活的标记疫苗。
本发明疫苗的产生如下进行。通过将C-株病毒在细胞培养系统(IFN仔猪胚肾细胞)中施加E2-TAV特异性抗体和CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清期间传代，选择天然存在的C-株“Riems”逃逸突变体。除肽处理的多克隆兔血清中所含有的抗体之外还施加的抗体特异性识别CSF病毒E2蛋白中的TAV-表位，并且通过与这个表位结合而中和CSF(C-株)病毒。CSFV因其RNA本质而显示高突变率。在提供中和抗体的选择性压力下，选出在与抗体结合的表位(在此情况下，TAV-表位)发生突变的病毒，由此未改变的野生型病毒被中和。通过在多种的抗体和兔血清的浓度以及混合物下多次传代，可以选出多个突变的病毒分离株。首先选出带有TAV-表位中置换的病毒。通过在多种类型的抗体压力下这些病毒的进一步传代，选出一种分离株，其显示在TAV-表位中的2个置换和El蛋白中的单个补偿性置换(El和E2之间的相互作用对于病毒结构是重要的)。将这些病毒置于其他抗体压力下，这导致分离出除El蛋白中的两个补偿性置换还在TAV-表位中带有3个置换的病毒。所得到的病毒(0株“虹61118，，07、(-株“1^61118”510和C-株“Riems，，011)还显示在E2蛋白中位置2862、2870和2889、3225处的置换，此外还有在ERNS蛋白中位置1649处的置换，还有在El蛋白位置2099和2122处的变化。表I :TAV逃逸突变体的进一步信息
权利要求
1.用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒， 特征在于E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含与野生型经典猪瘟病毒不同的序列， 由此所述病毒氨基酸序列显示以下置换的至少一种 -氨基酸830的置换；丙氨酸至缬氨酸， -氨基酸833的置换；脯氨酸至丝氨酸， -氨基酸839的置换；谷氨酸至甘氨酸。
2.根据前述权利要求所述的标记疫苗，其特征在于，修饰的病毒不通过重组DNA方法产生。
3.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换 -在核苷酸位置2862处的置换；T至C， -在核苷酸位置2870处的置换；G至A， -在核苷酸位置2889处的置换；G至A。
4.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，病毒的氨基酸序列显示一种或多种以下置换 -在蛋白质Ekns中氨基酸426的置换；异亮氨酸至缬氨酸， -在蛋白质El中氨基酸576的置换；酪氨酸至组氨酸， -在蛋白质El中氨基酸583的置换；天冬氨酸至谷氨酸， -在蛋白质E2中氨基酸951的置换；苏氨酸至异亮氨酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换 -在核苷酸位置1649处的置换；A至G, -在核苷酸位置2099处的置换；T至C， -在核苷酸位置2122处的置换；Τ至G， -在核苷酸位置3225处的置换；C至T。
6.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，TAV-表位的病毒氨基酸序列包含根据SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，病毒的氨基酸序列包含根据SEQ ID NO. I的序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，其特征在于，用所述疫苗治疗的受试者与被疾病相关性猪瘟病毒感染受试者能够通过使用血清学和/或基因组分析方法分析从所述受试者获得的生物学样品而被区分。
9.根据前述权利要求所述的标记疫苗，其特征在于，所述基因组分析方法基于聚合酶链反应(PCR)、优选地基于实时PCR，由此使用识别修饰的和/或疾病相关的病毒核苷酸序列的引物和/或探针。
10.根据权利要求8所述的标记疫苗，其特征在于，所述血清学分析方法基于酶免疫测定(EIA)、优选地基于酶联免疫吸附测定(ELISA)，由此使用与修饰的和/或疾病相关的TAV-表位特异性结合的抗体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的标记疫苗，通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的病毒逃逸突变体可获得。
12.制造修饰的减毒活经典猪瘟病毒疫苗株、优选权利要求I至11中任一项所述的疫苗的方法，包括通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的逃逸突变体。
13.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括 -在细胞培养下多次传代被疾病相关性猪瘟病毒感染的细胞、优选仔猪胚肾细胞，和 -同时施加针对疾病相关性猪瘟病毒E2蛋白的TAV-表位的抗体和/或CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清。
14.药物组合物，包含根据权利要求I至11中任一项所述的标记疫苗和可药用载体。
15.根据权利要求I至11中任一项所述的标记疫苗，作为药物用于经典猪瘟的预防性治疗(接种)中，优选地通过肌内注射或口服施加。
16.用于预防性治疗(接种)经典猪瘟的方法，包括将根据权利要求I至11中任一项所述的标记疫苗施用至、优选地通过肌内注射或口服施用至受试者、优选地是猪。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含与野生型经典猪瘟病毒不同的序列。本发明涉及这种标记疫苗的药物组合物。本发明还涉及一种使用选择性抗体压力制造用于预防经典猪瘟的标记疫苗的方法。
文档编号C07K14/18GK102905725SQ201180024834
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者马丁·贝尔, 桑德拉·布洛梅, 伊曼纽尔·莱费尔 申请人:里姆瑟药物股份公司