一种具有水溶性及聚集诱导发射效应的荧光探针和纳米粒及制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针及纳米粒，特别涉及一种具有水溶性以及具有聚集诱导发射效应的荧光探针或纳米粒，及它们的制备方法，特别还涉及荧光探针纳米粒在肝素的检测方面的应用，属于化学分析、分析检测技术领域。

背景技术：

荧光有机纳米粒(FONs)，通常由单分散态的低聚物或者是共轭结构的荧光团经过自组装形成。其与无机纳米粒相比具有灵活的合成方法，生物降解性，低毒性以及在水溶液中的稳定性等优点，目前已广泛应用于化学传感、光学材料、涂料、细胞成像、生物监测、生物体内成像及光动力治疗等领域(X.Zhang,X.Y.Zhang,L.Tao,Z.G.Chi,J.R.Xu,and Y.Wei.J.Mater.Chem.B.,2014,2,4398-4414.)。但是传统的荧光团在水溶液中通过自组装发生聚集时荧光将发生淬灭，这一缺陷将限制其在有机发光材料和生物成像等方面的应用。与传统的荧光团相比具有聚集诱导发射或聚集诱导发射增强的荧光团，在聚集态和固态条件下具有很强的荧光。聚集诱导发光分子的独特行为，引起了科学家的极大关注，成为了多功能光学材料研究领域的热点。聚集诱导发光型的纳米粒，由于其良好的生物相容性和高的荧光强度，在生物传感和生物成像领域具有极大的应用价值(R.T.K.Kwok,C.W.T.Leung,J.W.Y.Lam,and B.Z.Tang,Chem.Soc.Rev.,2014,13,4228–4238.)。

肝素(heparin)是一种直线、没有分枝的硫酸化的糖胺聚糖，主要由三硫酸化的二糖重复单元构成。肝素在调控生物体内各种生理过程起着关键的作用，例如，细胞生长、细胞分化、炎症、免疫防御、脂质转运等。肝素作为一种高效的抗凝剂，广泛地运用于临床上妊娠病人的抗凝血治疗以及外科预防血栓的形成，对于急性心肌梗死的患者，肝素还可以预防病人发生静脉栓塞。肝素的另一重要的临床运用是在心脏手术、肾脏透析的过程中维持病人血液体外循环的畅通。此外，肝素还可以用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血(DIC)、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征等。肝素的抗凝血作用主要是通过它和凝血酶蛋白抑制剂(抗凝血酶III)之间的相互作用来实现的。临床要求的肝素用于心血管外科手术和术后长期护理的剂量分别是2–8U mL^-1(17–67μM)和0.2–1.2U mL^-1(1.7–10μM)，因此临床使用肝素要严格控制其用量。肝素用量过多会引起自发性出血，临床表现为各种粘膜出血、关节腔积血、伤口出血等。肝素诱导的血小板减少症，是一种由药物诱导引发的血小板减少症，是肝素治疗中一重严重的并发症。鉴于过量的肝素可能引起的严重副作用，迫切需要发展一种高灵敏度和选择性的检测肝素含量的方法。

目前为止有许多用来检测肝素的方法。临床常用活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Phromboplastin Time，APPT)。方法是在血浆中加入钙离子、脑磷脂和其他激活物质如白陶土，这些物质激活内源性凝血级联系统，促进血浆凝固，而活化部分凝血活酶时间(APTT)就是血浆凝固所需的时间。肝素的用量可以根据APTT时间的长短来进行监测，从而找到最佳剂量范围。虽然APTT法操作简单、便宜，但是它是一种间接的检测方法、而且不能原位直接的检测病人血浆中肝素的含量，此外这种活化部分凝血活酶时间(APTT)的方法只能用于普通肝素检测，不能用于低分子肝素的检测。因此，非常期望开发一种高准确度并且可靠的监测肝素的新方法。最近几年由于荧光检测分析法的简单、快速、灵敏度高不需要昂贵的仪器等特点受到了极大的关注。许多基于有机小分子、聚合物、生物大分子检测肝素的荧光探针被报道。由于肝素本身具有丰富的负电荷，因此设计探针本身具有正电荷通过静电吸引的作用来检测肝素。这种策略经常用来设计荧光探针用于检测肝素。Cong Yu等人报道了一个多聚阳离子诱导的苯并[g,h,i]芘的荧光探针检测肝素，通过带负电荷的荧光团与多聚阳离子之间的静电作用力使荧光团发生聚集，加入高负电荷的肝素时，会与荧光团竞争性的结合多聚阳离子，通过荧光团的聚集状态的改变来比率型检测肝素(M.D.Yang,J.Chen,H.P.Zhou,W.Y.Li,Y.Wang,J.M.Li,C.Y.Zhang,C.B.Zhou and C.Yu,Biosens Bioelectron.,2016,75,404–410.)。虽然这一探针能够灵敏性的检测肝素，但是其需要额外加入多聚阳离子(PDA)，通过两步反应来检测肝素，血清中的带负电荷的生物大分子也能够竞争性的与PDA结合，对肝素的检测带来很大的干扰。此外,已报道的肝素的荧光探针其发射波长较短(小于600nm)，血液中带荧光的生物大分子也会对其荧光定量会产生影响。

技术实现要素：

针对现有检测肝素的荧光探针的性能存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种水溶性好，且同时具有聚集诱导效应的荧光探针。

本发明的第二个目的是在于提供一种具有聚集诱导效应的荧光探针纳米粒。

本发明的第三个目的是在于提供一种操作简单、原料易得的制备所述荧光探针的方法。

本发明的第四个目的是在于提供一种操作简单、条件温和的制备所述荧光探针的方法。

本发明的第五个目的是在于提供一种所述荧光探针纳米粒在检测肝素中的应用，利用其具有的水溶性及聚集诱导效应，通过肝素与其静电相互作用力，使荧光探针聚集形成聚集态而发射荧光来实现对肝素的检测，表现出灵敏、选择性高的特点。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有水溶性及聚集诱导发射效应的荧光探针，具有式1结构：

其中，

X^-选自I^-、ClO₄^-、Br^-或PF₆^-；

R₁、R₂和R₃独立选自氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、羧基或胺基。

优选的方案，式1中R₂和R₃均选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、羟基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基。

优选的方案，式1中R₁选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、羟基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基。

本发明还提供了一种荧光探针纳米粒，是由所述荧光探针聚集构成的纳米粒。

本发明还提供了一种制备所述的具有水溶性及聚集诱导发射效应的荧光探针的方法，该方法包括以下步骤：

1)2-甲基苯并噻唑与碘甲烷进行N取代反应，得到式2中间体；

2)对苯二甲醛、式3苯胺类化合物和式4苯偶酰类化合物在醋酸/醋酸铵体系中进行环化反应，得到式5中间体；

3)式2中间体与式5中间体在哌啶作用下进行缩合反应，得到式6目标产物，或者将式6目标产物与高氯酸盐、溴盐或六氟磷酸盐进行离子交换，得到含高氯酸根离子、溴离子或六氟磷酸根离子的目标产物；

其中，

R₁、R₂和R₃独立选自氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、羧基或胺基。

优选的方案，1)中的反应条件为：采用无水乙醇作为溶剂，在80～95℃反应4～8h。

优选的方案，2)中的反应过程为：将对苯二甲醛和所述苯胺类化合物在冰醋酸溶剂中搅拌0.5～1.5h，再加入所述苯偶酰类化合物和醋酸铵，在110～130℃温度下反应8～16h。

优选的方案，3)中的反应条件为：采用无水乙醇作为溶剂，哌啶作为催化剂，在80～95℃反应6～10小时。

本发明还提供了一种制备所述的荧光探针纳米粒的方法，将所述的荧光探针溶于有机溶剂后，加入到水溶液中，超声处理，即得荧光探针纳米粒。

优选的方案，有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、乙腈中的至少一种。

优选的方案，水溶液选自纯水、生理盐水、磷酸缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液或三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。

本发明还提供了所述荧光探针纳米粒的应用，将其应用于肝素的检测。

优选的方案将荧光探针纳米粒应用于化学溶液体系、生物体液或生物组织中肝素的荧光定量分析检测。

本发明的荧光探针具有咪唑环及四级铵盐结构，季铵盐带有正电荷，且在水中以分散的状态，而整个分子没有荧光，与肝素识别之后，由于肝素本身的高负电荷的特性，在分子间的静电作用力的诱导下荧光探针发生聚集从而发射出强的红色荧光。其检测原理图1。

本发明的具有水溶及聚集诱导效应荧光探针制备路线如下(以R₁、R₂和R₃为氢为例进行具体说明)：

本发明的具有水溶及聚集诱导效应的荧光探针的具体制备方法通过如下步骤实现：

a、2-甲基苯并噻唑溶于无水乙醇中，加入碘甲烷90℃加热回流，体系减压蒸馏出溶剂，乙醚重结晶，得到化合物1；

b、将对苯二甲醛和苯胺溶解于冰醋酸中，常温搅拌1小时，然后依次加入苯偶酰和醋酸铵混合均匀，继续加热120℃回流反应过夜，TLC检测反应完全后用氢氧化钠溶液调pH至近中性有沉淀产生，减压过滤得滤饼，干燥，柱色谱分离纯化得到化合物2。

c、将化合物2溶解于无水乙醇中，依次加入化合物1和哌啶体系混合均匀后，90℃加热回流，反应结束后，减压蒸馏除掉溶剂，柱色谱分离纯化得到化合物3；

d、将化合物3溶解在丙酮中常温搅拌，加入高氯酸钠或六氟磷酸钾的饱和水溶液，体系继续搅拌30min，过滤得滤饼，用蒸馏水洗涤，干燥得到对应的阴离子交换产物化合物4或5。

本发明的荧光探针纳米粒的制备方法通过如下步骤实现：

将化合物3、4或5充分溶解于有机溶剂中制备成母液，然后用移液枪吸取母液，在超声条件下加入到一定量的水溶液中，体系常温搅拌30min后即得检测肝素用的有机纳米粒。利用动态光散射(DLS)和扫描电镜(SEM)来观察形成纳米粒的粒径和形貌。

本发明的检测肝素的方法是充分利用了本发明提供的荧光探针在水溶液中具有分散性，且分散状态没有荧光，而在肝素存在时，通过肝素的静电相互作用力，使荧光探针聚集形成聚集态而发射荧光且发射波长大于600nm，本发明正是基于此而建立检测肝素的方法，该方法抗干扰强、灵敏度高，可以广泛推广应用。

本发明的荧光探针纳米粒能够用于化学模拟生物体系中肝素的检测；也可用于临床上检测血液中肝素的浓度，临床医学上血液、血清或组织中肝素的检测。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的荧光探针及纳米粒具有水溶性好、可以在水中分散的特点，且其具有聚集诱导发射效应，在聚集态时发射波长大于600nm的荧光，特别适用于荧光检测。

2)本发明的荧光探针及纳米粒的制备方法简单、成本低，有利于大规模生产。

3)本发明的荧光探针纳米粒用于检测血液中的肝素，该探针对肝素具有很好的选择性，人血清白蛋白，透明质酸，硫酸软骨素，ATP，氨基酸等对检测没有干扰，该纳米探针溶液的荧光强度与肝素的浓度在一定的浓度范围内(肝素的浓度范围0～1.2UmL^-1)具有良好的线性关系，显示出定量检测特性，完全可以满足临床上对术后长期护理中肝素浓度的检测的要求。

4)本发明的荧光纳米探针对肝素的响应时间短，测定的灵敏度高，发射波长位于红光区域血液中生物大分子对其干扰小，使得其适合推广运用。

附图说明

【图1】本发明实施例1中制备的荧光探针纳米粒的动态光散射图；

【图2】本发明实施例1中制备的荧光探针纳米粒的扫描电镜图；

【图3】本发明实施例1中荧光探针纳米粒的荧光强度与肝素浓度的线性关系，横坐标为肝素浓度，纵坐标为荧光强度；

【图4】本发明实施例1中荧光探针纳米粒对肝素的选择性；

【图5】为荧光探针纳米粒用于肝素检测的原理图。

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明内容，而不是对本发明权利要求保护范围的限定。

实施例1

本发明的聚集诱导荧光发射增强的化合物3(实例中R₁、R₂和R₃＝H，X＝I)的合成，合成路线如下：

化合物1的合成：称取2-甲基苯并噻唑(298mg，2mmol)溶解于10mL乙腈中，体系中加入碘甲烷(572mg，4mmol)，反应混合体系90℃回流6小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除掉溶剂，用乙醚重结晶，过滤，用30mL乙

醚洗涤三次，干燥得化合1，无需进一步的纯化直接进行下一步反应。

化合物2的合成：分别称去对苯二甲醛(1.34g,10mmol)和苯胺(930mg，10mmol)溶解在100mL冰醋酸当中，室温搅拌一小时。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸铵(5.4g，70mmol)顺序加入到反应体系中，化合物在120℃条件下反应过夜，反应结束后反应体系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氢氧化钠溶液调解体系pH至中性，混合物过滤用水洗三遍，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化得到产物。产率为40％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(500MHz，CDCl₃，ppm)δ＝9.98(s,1H)，7.76-7.78(d,2H)，7.62-7.65(m,4H)，7.36–7.23(m，9H)，7.16(m，2H)，7.09–7.11(d，2H).¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，ppm)δ＝191.70,145.34,135.47,130.23,129.39,128.78,128.37,128.26,126.91.

化合物3的合成：称取化合物2(200mg，0.5mmol)和化合物(220.5mg，0.5mmol)溶解在10mL无水乙醇中，加入1滴哌啶，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物3。产率为51％。核磁共振分析结果为：¹HNMR(500MHz,DMSO-D6):δ＝8.44-8.46(d,1H，J＝7.7Hz)，8.28-8.26(d,1H,J＝8.7Hz)，8.20-8.16(d,1H,J＝15.7Hz)，8.06-8.02(d,1H,J＝15.7Hz)，8.00-7.98(d,2H,J＝8.4Hz)，7.92-7.88(t,1H)，7.83-7.79(t，1H)，7.55-7.52(m，4H),7.41-7.27(d，13H)，4.35(s，3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-D₆):δ＝172.13,147.73,145.27,142.54,130.01,128.91,124.79,117.43,115.01,55.39,40.38,36.93,31.17,29.84,27.01,22.68.HRMS(m/z):计算值C₃₇H₂₈IN₃S,673.1049；发现[M-I]⁺,546.2007.

实施例2

水溶性有荧光有机纳米粒的制备：

用移液枪取20μL化合物3(1mM)的乙腈溶液，超声条下中加入到2mL的磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)中使化合物3的最终浓度为10μM。室温条件下搅拌30min体系有乳光产生，为了验证其纳米聚集行为，动态光散射实验测定其平均粒径为101nm，如附图1所示。

实施例3

制备的荧光有机纳米粒的扫描电子显微镜(SEM)测试：

吸取一滴实施例2中所制备的溶液，滴于铜网上，用滤吸干水分，自然晾干，置于扫描电镜中进行观察。扫描电镜图片如附图2所示。

实施例4

荧光纳米探针的荧光强度与肝素浓度的线性关系：

向实施例2中所制备的体系中分别加入10μL的肝素钠注射液，使肝素的最终浓度分别达到，0.05UmL^-1、0.1UmL^-1、0.15UmL^-1、0UmL^-1.2UmL^-1、0.3UmL^-1、0.4UmL^-1、0.5UmL^-1、0.6UmL^-1、0.7UmL^-1、0.8UmL^-1、0.9UmL^-1、1.0UmL^-1、1.2UmL^-1、1.4UmL^-1、1.6UmL^-1、1.8UmL^-1、2.0UmL^-1。所有测试溶液配制完成后，利用涡旋仪使其混合均匀。室温孵育10min后测量其在650nm处的荧光发射强度。所得结果如附图3所示，体系中650nm的荧光强度与肝素的浓度在0–1.2UmL^-1之间有很好的线性关系。

实施例5

荧光有机纳米对肝素检测的选择性：

使用实施例2中所制备的溶液作为荧光纳米探针，并评价该探针对肝素的选择性，该纳米探针的激发波长为380nm。该体系中化合3的浓度为10μM，分别向该体系加入肝素使其浓度为2.0UmL^-1，以及5倍摩尔单量的磷酸根、三磷酸腺苷、硫酸根醋酸根、透明质酸、谷氨酸、半胱氨酸，混合充分后，室温孵育10min后，测其荧光发射光谱并记录650nm处荧光发射的强度。结果如附图5所示，只有加入肝素的体系中产生强的红色荧光，而加入其它物种的溶液中几乎观察不到红色荧光。上述结果表明，该荧光有机纳米粒检测肝素具有良好的选择性和实际应用性。

最后，特别需要说明的是，以上举例仅是本发明的若干具体实施例。本发明显然不限于以上实例，本领域的相关技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。