一种双光子RNA荧光探针及其在活细胞成像中的应用的制作方法

本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种用于活细胞中RNA成像的双光子荧光探针。

背景技术：

在细胞内的各种生命物质中，核糖核酸(RNA)是重要的生物大分子，其在催化生物反应、基因表达调控等生物学过程中扮演着极其重要的角色。RNA主要存在于细胞核的核仁区和细胞质中，其定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息，这些信息与医学诊断和治疗息息相关。因此，核仁和细胞质中的RNA成像对生物化学、生物医药、生命科学等具有十分重要的意义。目前的荧光成像技术，尤其是双光子荧光成像技术，在实时监测活细胞中生物分子的形态、多寡等方面得到了广泛应用。双光子荧光成像技术具有高检测灵敏度、大的穿透深度、图像高保真、低的光毒性和光漂白性等优势，获得了生物、生命、医学等学科研究者们的青睐。为适应当前形势，各种能够成像活细胞内不同靶标的双光子荧光探针已成为研究热点。

与众多的商业化探针(如DNA探针)相比，RNA探针非常少。目前只有分子探针公司(Molecular Probes Co.)提供一个可用RNA成像的探针“SYTO RNA-Select”，但该探针的化学结构式仍未对外公布。专利CN103265947A、CN103275699A分别提供了一种用于活细胞成像的RNA荧光探针，但该探针未能实现双光子荧光成像。因此，在活细胞RNA荧光成像检测方面，依然缺乏优良的双光子荧光探针，这一现状亟待解决。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述不足，而提供一种双光子RNA荧光探针，该探针具有膜通透性好、细胞毒性小、显色强的特点。

本发明的另一目的是提供该双光子RNA荧光探针在标记或显示RNA在活细胞中分布的应用。

本发明采取的技术方案为：

一种双光子RNA荧光探针，结构通式如(I)所示：

其中：R为烷基、羟烷基或醚基；X为溴或碘。

上述双光子RNA荧光探针中：所述的R优选C_1-12的烷基、C_1-12的羟烷基或乙醚基；进一步优选甲基、乙基、丁基、十二烷基、羟乙基或乙醚基。

所述的双光子RNA荧光探针最优选2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(简称为IE)。

上述双光子RNA荧光探针的制备方法：

先卤代反应在2-甲基苯并噻唑氮上引入R基，并获得苯并噻唑盐，然后利用苯并噻唑盐与3-甲酰基吲哚通过knoevenagel反应得到最终产物。

所述的双光子RNA荧光探针(IE)的制备反应式如图1所示。

上述双光子RNA荧光探针在标记或显示RNA在活细胞中分布的应用。

所述的细胞为HeLa细胞。

将本发明双光子RNA荧光探针应用在HeLa细胞的染色，标记后的双光子荧光图像显示，在细胞的细胞质和核仁区有明显的荧光分布，明确提示所述探针能够在活细胞中专一性成像细胞质和核仁中的RNA，并在经核糖核酸酶(RNase)消化实验后的细胞进行对比实验后得到进一步证实。在HeLa细胞上用MTT法对所述探针的细胞毒性进行了研究，测试HeLa细胞在所述探针孵育2、4、8、12、24小时后的细胞存活率，在染色12小时之内，HeLa细胞的存活率还在90％以上，这表明本发明所述双光子荧光探针细胞毒性小，具有较好的膜通透性，能成像活细胞中细胞质和核仁区的RNA。

本发明双光子RNA荧光探针是一类新型的RNA选择性识别的双光子荧光探针，该探针具有膜通透性好、细胞毒性小、显色强的特点，可开发为RNA相关的生理、病理学研究用生物检测试剂。

附图说明

图1为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐的制备反应式；

图2为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的RNA双光子荧光滴定图；a为双光子荧光光谱；b为最大荧光强度随RNA与探针浓度比的变化图；

图3为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)对活性Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光照片；a为双光子荧光照片；b为明场激光扫描的微分干涉显微照片；c为ab两图的合并图(共定位图)；

图4为HeLa细胞经核糖核酸酶(RNase)处理前后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色的细胞照片对比图；a)为核糖核酸酶(RNase)处理前，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色HeLa细胞照片；b)为核糖核酸酶(RNase)处理前，明场激光扫描的微分干涉显微照片；c)为核糖核酸酶(RNase)处理后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色HeLa细胞照片；d)为核糖核酸酶(RNase)处理后，明场激光扫描的微分干涉显微照片；

图5为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)在HeLa细胞上的毒性(MTT)实验中细胞存活率随孵育时间的变化图；孵育时间：2、4、8、12、24小时，孵育浓度5μM。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明。

实施例1：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的合成

将2-甲基苯并噻唑(0.05mol，7.46g)与2-碘乙醇(0.05mol，7.81g)溶解在甲苯(50ml)中，搅拌4小时，随后回流反应30分钟，冷却至室温，过滤，乙醚洗涤，得到N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘盐。将N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘盐(0.01mol，0.32g)与3-甲酰基吲哚(0.01mol，0.145g)溶于甲醇(20ml)中，滴加几滴哌啶，回流反应4h，无水乙醇洗涤，得到褐色粉末，产率77％。

¹H NMR(400MHZ):12.478(s,1H),8.448(t,J＝7.66,2H),8.342(d,J＝7.96,1H),8.205(d,J＝4.96,1H),8.16(t,J＝9.72,1H),7.798(t,J＝7.76,1H),7.713(q,J＝9.29,1H),7.604(t,J＝5.4,2H),7.357(d,J＝4.36,2H),5.261(t,J＝5.68,1H),4.959(t,J＝4.34,2H),3.965(q,J＝4.88,2H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):173.40,144.44,142.06,138.38,137.87,129.23,127.81,127.27,,125.17,124.37,124.31,122.89,121.31,116.72,114.68,113.62,107.11。

实施例2：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-甲基苯并噻唑碘盐的合成

将(10mmol，1.49g)2-甲基苯并噻唑与(20mmol，2.84g)碘甲烷溶解在50ml甲苯中，搅拌4小时，随后回流反应30分钟，冷却至室温，过滤，乙醚洗涤，得到N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘盐。将(1mmol，0.291g)N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘盐与0.145g(1mmol)3-甲酰基吲哚溶于20ml甲醇中，滴加3滴哌啶，回流反应6h，无水乙醇洗涤，得到褐色粉末，产率70％。

IMT-M:1H NMR(400MHZ):12.497(s,1H),8.466(t,J＝10.6,2H),8.335(d,J＝8,1H),8.275(t,J＝4.42,1H),8.149(d,J＝8.36,1H),7.815(t,J＝7.72,1H),7.712(t,J＝7.64,1H),7.595(t,J＝4.5,1H),7.525(d,J＝15.76,1H),7.525(d,J＝15.76,1H),7.370-7.324(m,2H),4.277(s,3H).13C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):172.45,144.73,142.41,138.37,138.04,129.31,127.09,125.20,124.40,124.30,122.90,121.48,116.40,114.70,113.62,106.22。

实施例3：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-乙基乙基醚苯并噻唑溴盐的合成

将(10mmol，1.49g)2-甲基苯并噻唑与(20mmol，6.75g)2-溴乙基乙基醚溶解在50ml甲苯中，搅拌6小时，随后回流反应30分钟，冷却至室温，过滤，乙醚洗涤，得到N-乙基乙基醚-2-甲基苯并噻唑溴盐。将(1mmol，0.617g)N-乙基乙基醚-2-甲基苯并噻唑溴盐与(1mmol，0.145g)3-甲酰基吲哚溶于20ml甲醇中，并滴加3滴哌啶，回流反应7h，无水乙醇洗涤，得到褐色粉末，产率65％。

效果测试

(一)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的RNA双光子荧光滴定：

固定2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)在Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.2，Tris和KCl 100mmol/L)中的浓度，逐渐加入RNA，在800纳米激光辐照光下得到2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的双光子荧光滴定谱图，如图2所示。结果表明，随着RNA的不断加入，本发明所述探针的双光子荧光强度先是急剧增大，而后增大幅度放缓。这表明本发明的探针对RNA具有明显的荧光响应。

(二)HeLa细胞培养

HeLa细胞株贴壁培养于内含10％(v/v)胎牛血清和少量青霉素/链霉素的培养液中，在37℃、5％CO₂(v/v)的饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长到对数期，接片培养：将盖玻片于铬酸洗液中浸泡30分钟，清水、超纯水洗净，烘干，灭菌后放入一次性35mm无菌培养皿中；将100mL培养瓶中的培养基小心地倒出，细胞用PBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)洗2遍，用l mL 0.25％(质量分数)胰蛋白酶液消化2～3分钟，倒掉胰蛋白酶液，加入少量新鲜培养基吹打均匀成细胞悬浮液，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积吹打均匀，而后将细胞接种至内含盖玻片的培养皿中，放入培养箱中培养，使细胞爬片生长。24～48h后，生长至细胞密度达50％～70％，待染色。

(三)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)对HeLa细胞的染色观察：

将2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)配成1mM DMSO母液，染色时用PBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)稀释至5μM。将接种好的细胞在5μM的探针分子溶液中，37℃条件下孵育30min，用PBS洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上；然后把样品置于载物台上荧光成像。结果见图3，双光子荧光图像显示在细胞质和核仁区有明显的荧光分布，表明本发明的探针能够在活细胞中专一性的成像细胞质和核仁中的RNA。

(四)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)探针对HeLa细胞、RNase消化处理后的HeLa细胞的染色观察：

固定细胞制备：将培养的HeLa细胞浸泡于4％(质量分数)多聚甲醛溶液30分钟，或者用-20℃甲醇固定15分钟，而后用0.5％Triton X-100室温通透2分钟，得到待染色固定细胞。

取两组上述固定细胞，用浓度为5μM的2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)探针溶液在CO₂培养箱中孵化染色30分钟。用PBS对两组细胞冲洗2遍，向其中一组加入25mg/mL DNase-Free RNase(GE)(核糖核酸酶)，然后两组细胞在37℃、5％CO₂条件下孵育2小时。随后，用PBS冲洗2次，在宽场显微镜下观察、记录两组细胞中荧光分布及亮度变化等。

结果见图4，未经RNase消化处理的HeLa细胞的荧光主要集中在细胞质和核仁区域；而经RNase消化处理后的HeLa细胞的荧光集中到了细胞核区域，其细胞质和核仁区域基本没有荧光。由于RNase仅能水解掉细胞中的RNA，因此，该实施例可以证实本发明的探针能够选择性成像细胞中的RNA。

(五)MTT细胞毒性实验

收集对数期HeLa细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)后开始分别在0、12、16、20、22h的时间加入5μM的2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)荧光探针。到贴壁24h时每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。然后，再向每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

结果见图5，HeLa细胞在5μM 2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)孵育2、4、8、12、24小时后的细胞存活率，在染色12小时之内，HeLa细胞的存活率还在90％以上，这表明本发明所述双光子荧光探针能成像活细胞中细胞质和核仁区的RNA。

以上是结合具体实施例对本发明的详细介绍，本发明的保护范围不限于此。