具有最小单体分离的重组多克隆抗体多聚体的分离的制作方法
【专利说明】具有最小单体分离的重组多克隆抗体多聚体的分离 发明领域
[0001] 本发明涉及从重组多克隆抗体（rpAb)的制剂中分离抗体多聚体（多聚体）。 发明背景
[0002] 对重组生物制药制剂中的多聚体和多聚体的控制是令人感兴趣的，因为这些物质 潜在地造成安全性和免疫原性的问题（罗森伯格（R〇senberg)，A. S. (2006)AAPSJ 8:59; G.尚卡尔（Shankar)，G.等人（2007)自然生物技术（Nat.Biotechnol).25:555;科尔多 瓦-罗德里格斯（Cordoba_Rodriguez)，R· (2008)国际生物制药（Biopharm.Int. )21:44)〇 对于重组多克隆抗体（mAb)，通常使用离子交换色谱法来实现多聚体的分离，其中最终抗体 制剂的单体纯度经常超过99% (苏达（Suda)，E. J.等人（2009)色谱法杂志A卷（J. Chrom. △?) 1216:5256;周（211〇11)，1乂.等人（2007)色谱法杂志八卷1175:69;￥丨823￥(伊格佐耳）， Y.等人（2009)当代药物生物技术（Curr.Pharm. Biotechnol. )10:421)。对于来源于人血 浆的多克隆IgG制剂，IgG多聚体的水平较高，在IVIG制剂的一项研究中该IgG多聚体的水 平在5%-18%的范围内（克内热维奇-马拉米察（1(1^6￥；[(3-]\&1抑1]1；^3)，1.等人（2003) 输血杂志（Transfusion) 43:1460)。与mAb相比，在商业多克隆IVIG制剂中所见的多聚体 水平较高的部分原因是材料的性质不同（例如，等电点的范围和IgG亚类）。虽然出于治疗 原因维持血浆来源的IVIG的完全多样性是重要的，但也使得分离多聚体而不同时分离基 于特征（如电荷）而不同的IgG单体极其困难（福雷尔（Forrer)，N.等人（2008)色谱法 杂志 A 卷 1214:59)。
[0003] 重组多克隆抗体（rpAb)代表一类新颖的能够靶向多种抗原的生物药剂。为了降 低成本，可预料的是，将以单个批次制造用于治疗使用的rpAb，其中各个组分mAb在相同生 物反应器中共表达并且一起纯化（拉斯马森（Rasmussen)，S.K.等人（2012)生物化学与生 物物理学集刊（Arch. Biochem. Biophys.) 526:139)。
[0004] 与mAb类似，对于rpAb，希望将多聚体物质控制在低水平下。与mAb不同，rpAb 纯化增添了另外的约束，即各个组分mAb的相对比率被控制在窄范围内（T.P弗兰德森 (Frandsen)，T.P.等人（2011)生物技术（Biotech. Bioeng. )108:2171)。这个问题提出了 重大挑战，因为需要分离不希望的物质（多聚体）而不同时分离代表rpAb混合物的mAb的 不同组，从而确保抗体相对比率被维持在窄范围内。以另一种方式说明该问题，多克隆混合 物的组分mAb必须一起共纯化而多聚体物质不能。对于这类具有挑战性的分离，用于mAb 的传统方法如离子交换色谱法可能并不合适。
[0005] 我们已经出乎意料地发现了实现同时具有最小单体分离的重组多克隆抗体多聚 体的分离的方法。 发明概述
[0006] 本发明提供一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方法 包括使一种包含多种单克隆抗体的混合物经受至少一种分离方法，从而产生一种基本上不 含多聚体的抗体单体制剂，该至少一种分离方法选自下组，该组由以下各项组成：多模式色 谱法、磷灰石色谱法以及疏水相互作用色谱法。
[0007] 在一些实施例中，该混合物经受至少两种分离方法，从而产生基本上不含多聚体 的抗体单体制剂，该至少两种分离方法选自下组，该组由以下各项组成：多模式色谱法、磷 灰石色谱法以及疏水相互作用色谱法。
[0008] 在其他实施例中，该分离方法是单独多模式色谱法。在其他实施例中，该分离方法 是单独磷灰石色谱法。在其他实施例中，该分离方法是单独疏水相互作用色谱法。
[0009] 在一些实施例中，该分离方法是多模式色谱法和磷灰石色谱法。在一些实施例中， 该分离方法是多模式色谱法和疏水相互作用色谱法。在一些实施例中，该分离方法是磷灰 石色谱法和疏水相互作用色谱法。在一些实施例中，该混合物经受多模式色谱法、磷灰石色 谱法以及疏水相互作用色谱法，从而分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离。
[0010] 在一些实施例中，由该方法产生的抗体制剂是至少90%至91%不含多聚体。在其 他实施例中，该抗体制剂是至少92 %至93 %不含多聚体。在其他实施例中，该抗体制剂是 至少94%至95 %不含多聚体。在其他实施例中，该抗体制剂是至少96 %至97 %不含多聚 体。在其他实施例中，该抗体制剂是至少98%至99%不含多聚体。在其他实施例中，该抗 体制剂是100 %不含多聚体。
[0011] 在一些实施例中，相对于rpAb混合物中的任何其他抗体单体，任何抗体单体的量 变化小于40 %。在其他实施例中，相对于rpAb混合物中的任何其他抗体单体，任何抗体单 体的量变化小于30 %。在其他实施例中，相对于rpAb混合物中的任何其他抗体单体，任何 抗体单体的量变化小于20 %。在其他实施例中，相对于rpAb混合物中的任何其他抗体单 体，任何抗体单体的量变化小于10 %。在其他实施例中，相对于rpAb混合物中的任何其他 抗体单体，任何抗体单体的量变化小于5 %。在其他实施例中，相对于rpAb混合物中的任何 其他抗体单体，任何抗体单体的量变化〇 %。
[0012] 本发明还提供一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方 法包括使包含多种单克隆抗体的混合物接触多模式色谱法树脂，并且使用包含缓冲物质和 在0M与1M之间的盐的至少一种洗脱缓冲液，从所述树脂上洗脱抗体单体。
[0013] 本发明还提供一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方 法包括使包含多种单克隆抗体的混合物接触磷灰石色谱法树脂，并且使用盐的逐步改变或 线性梯度以使电导率从小于lmS/cm增加至大于90mS/cm或在lmS/cm与90mS/cm中间的任 何范围，从所述树脂上洗脱抗体单体。例如，可以使用盐的逐步改变以使电导率从5mS/cm 增加至20mS/cm来洗脱柱。
[0014] 本发明还提供一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方 法包括使包含多种单克隆抗体的混合物接触疏水相互作用色谱法树脂，并且使用盐的逐步 改变或线性梯度以使电导率从大于200mS/cm减小至小于lmS/cm或在200mS/cm与lmS/cm 中间的任何范围，从所述树脂上洗脱抗体单体。例如，可以使用盐的逐步改变以使电导率从 60mS/cm减小至10mS/cm来洗脱柱。 附图简要说明
[0015] 图1示出含有以近似1:1:1比率的mAb A、mAb B以及mAb C的rpAb混合物的波 罗斯 50HS(P0R0S 50HS)色谱法。
[0016] 图2示出含有以近似1:1:1比率的mAb A、mAb B以及mAb C的rpAb混合物的 Capto Adhere 色谱法。
[0017] 图3示出含有以近似1:1比率的mAb A和mAb B的rpAb混合物的Capto Adhere 色谱法。
[0018] 图4示出含有以近似1:1比率的mAb A和mAb B的rpAb混合物的羟基磷灰石色 谱法。
[0019] 图5示出含有以近似1:1比率的mAb A和mAb B的rpAb混合物的丁基色谱法。 详细说明 引g
[0020] rpAb的纯化提出了特殊挑战，因为当多种单克隆抗体在细胞培养物中共表达时， 可以产生不同的多聚体物质或多聚体。虽然用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的不同技 术是已知的，但没有料到任何这些技术可以纯化多克隆抗体掺合物（或混合物？）内的单 克隆抗体的单体同时将这些单克隆抗体的相对比率维持在窄范围中，这些单体具有不同的 化学特性和物理特性如等电点（(pi))、疏水性以及尺寸。 定义
[0021] 如在此所使用，"抗体"意指包括由多肽链的折叠形成的至少一个结合结构域的多 肽或一组多肽，这些多肽链具有三维结合空间，其中内表面形状和电荷分布与抗原的抗原 决定簇的特征互补。抗体典型地具有四聚体形式，包括两对相同的多肽链，每对具有一个轻 链和一个重链。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。如在此所使用，术语"抗体" 还涵盖双特异性抗体。
[0022] 如在此所使用，"磷灰石色谱法"意指依赖于分析物蛋白质与固定相磷灰石树脂上 的带正电钙离子和带负电磷酸根离子之间的非特异性相互作用的分离类型。这种类型的色 谱法包括，例如，通过与钙离子和磷酸根离子的非特异性相互作用来与蛋白质相互作用的 羟基磷灰石和氟磷灰石。
[0023] 如在此所使用，"疏水相互作用色谱法"意指依赖于分析物蛋白质的疏水部分在高 盐条件下结合到树脂上，但这些疏水部分在低盐条件下洗脱的分离类型。
[0024] 如在此所使用，"最小单体分离"是指相对于混合物中的任何其他抗体单体，从原 始混合物中仅去除少量的抗体单体。通常，相对于任何其他单体，分离的量将小于来自原 始混合物的单体的40%。优选地，该量将小于30%。更优选地，该量将小于20%。更优选 地，该量将小于10%。仍更优选地，该量将小于5%。在一些实施例中，将不存在单体分离 (0% ) 〇
[0025] 如在此所使用，"单克隆抗体（mAb) "是指克隆制剂中的抗体，其中该制剂中的每种 抗体具有结合相同表位的单一特异性。
[0026] 如在此所使用，"单体"意指不具有多聚体的单一抗体分子。
[0027] 如在此所使用，"多聚体"意指抗体的高分子量聚集体。
[0028] 如在此所使用，"多模式色谱分析"是指依赖于固定相与分析物之间的多于一种 相互作用模式以实现分离的技术。例如，多模式色谱法可以依赖于与这些相互作用中的另 一种组合的一种或多种以下类型的色谱法：离子交换色谱法（IEC)、疏水相互作用色谱法 (HIC)、反相液相色谱法（RP