来洗脱，其中该逐步或梯度是从约〇. 6M至0M盐。在一些实施例中，使用 逐步或线性梯度的不断减少的硫酸钠来洗脱，其中该逐步或梯度是从约〇. 6M至0M硫酸钠。 在一些实施例中，该pH是在约6. 2至8. 0的范围内。在一些实施例中，该pH是在约6. 8至 7. 2的范围内。在一些实施例中，该pH是7.0。
[0053] 可以基于在峰前部的25mAU处和在峰尾部的25mAU处的吸光度来收集产物。
[0054] 在本发明的该方法中，去除多聚体以使得抗体制剂是至少90%不含多聚体。在一 些实施例中，该制剂是至少91 %不含多聚体。在一些实施例中，该制剂是至少92%不含多 聚体。在一些实施例中，该制剂是至少93%不含多聚体。在一些实施例中，该制剂是至少 94%不含多聚体。在一些实施例中，该制剂是至少95%不含多聚体。在一些实施例中，该 制剂是至少96%不含多聚体。在一些实施例中，该制剂是至少97%不含多聚体。在一些实 施例中，该制剂是至少98 %不含多聚体。在一些实施例中，该制剂是至少99 %不含多聚体。 在一些实施例中，该抗体制剂是100 %不含多聚体。
[0055] 可以在本发明的这些方法中使用的树脂是本领域中熟知的并且是商业上可获得 的。
[0056] 分离重组多克隆抗体多聚体的方法可以采用多模式色谱法树脂，其中rpAb接触 该树脂，并且这些多聚体被结合到该树脂上而单体被收集在柱流过液中。
[0057] 分离重组多克隆抗体多聚体的方法可以采用多模式色谱法树脂，其中rpAb被结 合到该树脂上并且使用至少一种洗脱缓冲液从该树脂上洗脱单体，其中该洗脱缓冲液包含 缓冲物质和在0M与1M之间的盐
[0058] 分离重组多克隆抗体多聚体的方法可以采用多模式色谱法树脂，其中rpAb接触 该树脂，并且这些多聚体被结合到该树脂上而单体被收集在柱流过液中。
[0059] 分离重组多克隆抗体多聚体的方法可以采用磷灰石色谱法树脂，其中rpAb被结 合到该树脂上并且使用至少一种洗脱缓冲液从该树脂上洗脱单体，其中该洗脱缓冲液是 盐的逐步改变或线性梯度以使电导率从小于lmS/cm增加至大于90mS/cm或在lmS/cm与 90mS/cm中间的任何范围。
[0060] 分离重组多克隆抗体多聚体的方法可以采用疏水相互作用色谱法树脂，其中rpAb 被结合到该树脂上并且使用至少一种洗脱缓冲液从该树脂上洗脱单体，其中该洗脱缓冲液 是盐的逐步改变或线性梯度以使电导率从小于200mS/cm减小至小于lmS/cm或在200mS/cm 与lmS/cm中间的任何范围。
[0061] 该方法还可以包括在这些特定条件下的这三种分离技术的组合。
[0062] -般会考虑抗体的pi和疏水性分布（profile)以便指导如将为本领域技术人员 已知的结合和洗脱条件以及流过条件。
[0063] 通过参考以下实例将更容易理解如今总体上描述的本披露，这些实例仅被包括用 于说明本披露的某些方面和实施例的目的，并不旨在限制本披露。例如，在此披露的具体构 建体和实验设计代表示例性的用于验证适当功能的工具和方法。 实例 A.材料和方法 1. 化学品
[0064] 所有化学品是USP级或相当级别的。 2. mAb和rpAb混合物
[0065] 使用生物技术中普遍采用的细胞培养技术和纯化技术来表达并且纯化单克隆抗 体。在使用广泛可获得的细胞系如CH0或NS0的标准细胞培养程序之后，对每种mAb的纯 化包括至少蛋白A捕获和离子交换柱以便去除与方法相关的杂质。在以下表1中概述了各 个mAb特性。为了产生rpAb混合物，然后以近似1:1或1:1:1 (按质量计）的比率混合各 个mAb，对应地用于两种或三种mAb rpAb混合物。为了在rpAb混合物中获得所希望的各 个mAb的多聚体水平，首先以适当的比率组合含有高多聚体水平或低多聚体水平的纯化的 mAb，以便在组合各个mAb之前得到正确的多聚体水平。这产生了具有mAb比率和多聚体水 平明确定义的组成的rpAb混合物。 表1. mAb特性的概述
3. rpAb总蛋白浓度测量
[0066] 通过使用来自赛默飞（Thermo)(威尔明顿（Wilmington)，DE)的 Nanodrop 2000c 在280nm处的吸光度来测量rpAb混合物的蛋白质浓度。对于每种混合物，使用各个mAb组 分（1:1或1:1:1混合物）的加权平均数来估算消光系数。各个mAb的消光系数可以见于 表1中。 4. 阳离子交换色谱法
[0067] 在典型的结合和洗脱条件下，在具有20cm台高的小型色谱柱中进行使用波罗斯 HS50(美国生命技术公司（Life Technologies)，所在地）的阳离子交换色谱法（CEX)。使用 来自通用医疗（GE Healthcare)(皮斯卡塔韦，美国新泽西（Piscataway，NJ USA))的AKTA Explorer液体色谱系统进行所有运行，并且在300cm/h下操作柱。使用25mM乙酸盐、25mM 氯化钠 （pH 5.0)对柱进行平衡，并且然后使用总蛋白浓度上样至每升树脂30g蛋白质。上 样后，对柱进行重新平衡，并且然后用从25mM至260mM的氯化钠的线性梯度经过20个柱体 积洗脱。基于在产物峰前部和尾部的25mAU处的吸光度标准来收集产物峰。 5. 多模式色谱法
[0068] 在典型的流过条件下，在装填到20cm床高的小型色谱柱中进行使用Capto Adhere(通用医疗，皮斯卡塔韦，美国新泽西）的多模式色谱法（MMC)。使用来自通用医疗 (皮斯卡塔韦，美国新泽西）的AKTA Explorer液体色谱系统进行所有运行，并且在300cm/ h下操作柱。使用25mM乙酸盐、100mM氯化钠 （pH 5. 0)(用于mAb A、mAb B以及mAbC的混 合物）或使用50mM三羟甲基氨基甲烷、lOOmM氯化钠 （pH 7. 25) (mAb A和mAb B混合物） 对柱进行平衡。使用总蛋白浓度将柱上样至每升树脂50g蛋白质，并且使用平衡缓冲液重 新平衡。基于在产物峰前部和尾部的25mAU处的吸光度标准来收集产物峰。 6. 疏水相互作用色谱法
[0069] 在典型的结合和洗脱条件下，在具有20cm台高的小型色谱柱中进行使用来自东 曹生物科技有限公司（Tosoh Bioscience)(普鲁士王，美国宾州（King of Prussia，PA USA))的Toyopearl 丁基650M的疏水相互作用色谱法（HIC)。使用来自通用医疗（皮斯卡 塔韦，美国新泽西）的AKTA Explorer液体色谱系统进行所有运行，并且在300cm/h下操作 柱。使用25mM磷酸盐、0. 6M硫酸钠 （pH 7. 4)对柱进行平衡。通过使用1份25mM磷酸盐、 1. 2M硫酸钠（pH7. 4)稀释1份（按体积计）蛋白质溶液来制备上样液，并且然后使用总蛋 白浓度（以上所述）将柱上样至每升树脂l〇g蛋白质。上样后，使用平衡缓冲液对柱进行 重新平衡，并且然后用从〇. 6M至OmM的硫酸钠的线性梯度经过20个柱体积洗脱。基于在 产物峰前部的25mAU处和在峰尾部的lOOmAU处的吸光度标准来收集产物峰。 7. 羟基磷灰石色谱法
[0070] 在典型的结合和洗脱条件下，在具有20cm台高的小型色谱柱中进行使用来自伯 乐生命医学产品（Bio-Rad Laboratories)(赫拉克勒斯，加州，美国（Hercules，CA, USA)) 的陶瓷羟基磷灰石（Ceramic Hydroxyapatite) I型的羟基磷灰石色谱法。使用来自通用 医疗（皮斯卡塔韦，美国新泽西）的AKTA Explorer液体色谱系统进行所有运行，并且在 300cm/h下操作柱。使用10mM磷酸盐（pH 7.0)对柱进行平衡，并且然后使用总蛋白浓度 (如上所述）上样至每升树脂20g蛋白质。上样后，对柱进行重新平衡，并且然后用从0M至 1M的氯化钠的线性梯度经过20个柱体积洗脱。基于在产物峰前部的25mAU处和在峰尾部 的50mAU处的吸光度标准来收集产物峰。 8. 分析尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC)
[0071] 使用具有安捷伦（Agilent) 1200高效液相色谱（Agilent 1200HPLC)系统（帕洛 阿尔托，加州，美国（Palo Alto, CA，USA))的从东曹生物科技有限公司（所在地）获得的 TSK-GEL G3000SWa来进行分析高性能尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC)。流动相是在lmL/min下 的0. 1M磷酸钠、0. 1M硫酸钠（pH6. 8)，持续20分钟。注射45ug的纯样品并且使用来自伯 乐（赫拉克勒斯，美国加州）的分子量标准品来对柱进行校准。使用分光光度计在280nm处 监测洗脱曲线，并且使用来自安捷伦的化学工作站（ChemStation)软件收集并分析数据。 9. 分析反相色谱法（RP-HPLC)
[0072] 使用连接到沃特世公司（Waters)ACQUITY UPLC Η-Class Bio系统（米尔福德 港，马萨诸塞州，美国（Milford，MA，USA))上的购自美国Michrom生物有限公司（Michrom Bioresources, Inc.)(奥伯恩，加州，美国（Auburn, CA, USA))的 PLRP-S 柱（8 μ m 颗粒， 4000A，2. OmmX 150mm)来进行分析RP-HPLC。使用三种洗脱液来产生针对每种类型的蛋白 质混合物而定制的适当的流动相和梯度。这三种洗脱液是：水（洗脱液A)、乙腈（洗脱液 B)以及2%三氟乙酸（TFA)的水溶液（洗脱液C)。在每次洗脱过程中，使洗脱液C的百分 比保持恒定（TFA浓度：0. 02% -0. 1 % )，而增加洗脱液B与洗脱液A的比率以形成所希望 的梯度。将流速设定在〇.2ml/min下并且将柱温维持在70°C下。使用光电二极管阵列检 测器监测每种蛋白质混合物的洗脱，并且选择在280nm或220nm处获取的峰响应用于定量。 通过注射使用相同蛋白质的参考标准品而制备的标准溶液来确定样品中的每种蛋白质的 浓度。 实例1 :阳离子交换色谱法（mAb A/mAb B/mAb C)
[0073] 阳离子交换色谱法（CEX)经常用于mAb多聚体去除。在典型的结合和洗脱条件 下，多聚体物质比单