使用包括单体物质和多聚体物质这两者 的RP-HPLC浓度来确定的。总之，已经显示羟基磷灰石是用于rpAb混合物中的多聚体去除 的有效工具。 表5. mAb C和mAb D的rpAb混合物的羟基磷灰石色谱法的概述。
实例5-疏水相互作用色谱法（mAb A/mAb B)
[0081] 疏水相互作用色谱法（HIC)是基于疏水性的差异而分离蛋白质的一种常见色谱 法模式。一段时间以来，HIC已经被广泛用于蛋白质的纯化，并且已经被证明作为用于mAb 纯化的多聚体去除的选项（陈，J.等人（2008)色谱法杂志A卷1177:272)。当用于mAb多 聚体去除时，典型地使用含有高浓度离液盐（硫酸铵或硫酸钠是最常见的）的中性缓冲液 对柱进行平衡。调节上样液以便具有类似浓度的离液盐，并且在这些条件下单体和多聚体 可以结合到HIC树脂上。典型地使用线性梯度或步骤的含有较低离液盐浓度（或根本没有 盐）的缓冲液，从柱上洗脱产物。通常，多聚体更牢固地结合到柱上并且在较低盐浓度下洗 脱，或作为分离的可分辨峰或作为单体峰的尾部上的肩峰。还可以在其中多聚体牢固地结 合到柱上而单体产物穿过柱具有很少结合或不结合的条件下，在流过模式中操作HIC。虽然 使用HIC色谱法的多聚体去除在mAb纯化中是常见的，但应用HIC色谱法以去除rpAb混合 物中的多聚体并不是那样简单。因为每种mAb具有不同数目的疏水性氨基酸或不断变化的 表面疏水性分布，所以可以被选择使得去除多聚体而不会从rpAb混合物中选择性去除各 个mAb的最佳条件并不是显而易见的。
[0082] 为了测试HIC色谱法去除rpAb混合物中的多聚体的能力，我们使用Toyopearl 丁 基650M树脂研究了 mAb A和mAb B (以近似1:1的比率）的混合物的纯化。使用从0. 6M 至0M硫酸钠的线性梯度的不断减少的硫酸钠浓度，在结合和洗脱模式中操作该柱。在本实 例中，混合物中的多聚体以类似的水平来自这两种mAb(即，来自每种mAb的多聚体水平是 大约3. 2% )。在上样液中测量的组合的多聚体水平是6. 3%。图5示出rpAb混合物的丁 基色谱图。如在该色谱图中可以看出，各个mAb共同洗脱在单峰中，其中没有观察到mAb的 分离。如果存在各个mAb的分离，将会观察到具有近似类似的区域的多个峰（如在图1中 的CEX曲线中看出）。观察到在单体峰的尾部上洗脱的一个小峰，并且通过SEC-HPLC显示 这个峰是多聚体。本实例具有93. 2%的单体产率。表6概述了上样液和池液分析数据。如 在表6中可以看出，多聚体从上样液中的6. 3%减少至HIC池液中的0. 3%。同时，在丁基 650M色谱法之前（0.98)和之后（1.00)，mAb B与mAb A (B:A)的比率保持相对恒定。因此， HIC能够从单体中分离多聚体而不同时分离各个mAb。 表6. mAb A和mAb B的rpAb混合物的丁基色谱法的概述。
[0083] 由于多聚体物质的已知的免疫原性，在mAb纯化过程中对多聚体物质的控制是重 要的。可预料的是，将在用于人使用的rpAb生产中要求对多聚体物质的控制。与mAb不同， 可预期的是，rpAb治疗剂将具有另外的约束，即各个mAb的比率必须被控制在窄范围中。因 此，必须去除多聚体和多聚体同时维持各个组分mAb的比率。
[0084] 对于mAb生产，常规地使用离子交换色谱法来控制多聚体水平；然而，由于各个 mAb中的电荷异质性，在许多情况下使用CEX在rpAb混合物中控制多聚体将是不可行的。先 前已经采用了其他色谱技术如疏水相互作用、磷灰石以及多模式色谱法用于mAb多聚体去 除，然而，因为这些模式往往比离子交换更有选择性，可预料的是，当试图分离多聚体物质 时，这些技术将分离rpAb混合物的组分单体。相当出乎意料的是，我们发现观察到相反的 结果。实验证明疏水相互作用、磷灰石以及多模式色谱法可以将rpAb混合物中的各个mAb 比率保持在窄范围内同时分离不希望的多聚体。
[0085] 在这项工作中，我们证明了多模式、磷灰石以及疏水相互作用色谱法用于rpAb多 聚体去除的能力。使用两种或三种mAb混合物，我们显示出每种模式的色谱法能去除大于 2. 5%多聚体（在一些情况下多聚体来自多种mAb物质）的能力，以便产生>99%单体的 rpAb产物。同时，我们能够将所希望的mAb比率（色谱法之前和之后）维持在10%以内。
[0086] 在此提及的所有公开物和专利特此以其全文通过引用而结合，如同每个单独的公 开物或专利被明确且单独地表明通过引用而结合。
[0087] 虽然已经讨论了本披露的具体实施例，但上述说明书是说明性而非限制性的。通 过回顾本说明书和以下权利要求，本披露的多种变体对于本领域的技术人员而言将变得明 显。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同这类变体，确定 本披露的全部范围。
【主权项】
1. 一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方法包括使一种包 含多种单克隆抗体的混合物经受至少一种分离方法，从而产生一种基本上不含多聚体的抗 体单体制剂，该至少一种分离方法选自下组，该组由以下各项组成：多模式色谱法、磷灰石 色谱法以及疏水相互作用色谱法。2. 如权利要求1所述的方法，其中该混合物经受至少两种分离方法，从而产生基本上 不含多聚体的抗体单体制剂，该至少两种分离方法选自下组，该组由以下各项组成：多模式 色谱法、磷灰石色谱法以及疏水相互作用色谱法。3. 如权利要求1所述的方法，其中该分离方法是多模式色谱法。4. 如权利要求1所述的方法，其中该分离方法是磷灰石色谱法。5. 如权利要求1所述的方法，其中该分离方法是疏水相互作用色谱法。6. 如权利要求2所述的方法，其中该分离方法是多模式色谱法和磷灰石色谱法。7. 如权利要求2所述的方法，其中该分离方法是多模式色谱法和疏水相互作用色谱 法。8. 如权利要求2所述的方法，其中该分离方法是磷灰石色谱法和疏水相互作用色谱 法。9. 如权利要求1所述的方法，其中该混合物经受多模式色谱法、磷灰石色谱法以及疏 水相互作用色谱法，从而分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离。10. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是至少90%至91%不含 多聚体。11. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是至少92%至93%不含 多聚体。12. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是至少94%至95%不含 多聚体。13. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是至少96%至97%不含 多聚体。14. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是至少98%至99%不含 多聚体。15. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂是100%不含多聚体。16. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化小于40%。17. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化小于30%。18. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化小于20%。19. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化小于10 %。20. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化小于5%。21. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相对于该rpAb混合物中的任何其他抗 体单体，任何抗体单体的量变化ο%。22. -种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方法包括使一种 包含多种单克隆抗体的混合物接触一种多模式色谱法树脂，并且使用包含缓冲物质和在0Μ 与1Μ之间的盐的至少一种洗脱缓冲液，从所述树脂上洗脱抗体单体。23. 如权利要求22所述的方法，其中所述多模式色谱法树脂包含具有疏水部分和离子 交换部分两者的配体。24. 如权利要求23所述的方法，其中所述多模式色谱法树脂是CaptoAdhere色谱法树 脂。25. 如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中用线性或逐步梯度的盐洗脱所述单 体。26. 如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中使用单一浓度的盐从该柱上洗脱这 些单体。27. -种分离重组多克隆抗体多聚体而不分离单体的方法，该方法包括使一种包含多 种单克隆抗体的混合物接触一种磷灰石色谱法树脂，并且使用一种盐的逐步改变或线性梯 度以使电导率从小于lmS/cm增加至大于90mS/cm或在lmS/cm与90mS/cm中间的任何范围， 从所述树脂上洗脱抗体单体。28. 如权利要求27所述的方法，其中所述磷灰石色谱法是羟基磷灰石色谱法。29. 如权利要求27或28所述的方法，其中所述盐是氯化钠。30. -种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方法包括使一种 包含多种单克隆抗体的混合物接触一种疏水相互作用色谱法树脂，并且使用一种盐的逐步 改变或线性梯度以使电导率从大于200mS/cm减小至小于lmS/cm或在200mS/cm与lmS/cm 中间的任何范围，从所述树脂上洗脱抗体单体。31. 如权利要求30所述的方法，其中所述盐是硫酸钠。
【专利摘要】本发明提供一种用于从重组多克隆抗体(rpAb)的制剂中去除多聚体同时将单体的比率维持在窄范围内的方法。本发明提供一种分离重组多克隆抗体多聚体而具有最小单体分离的方法，该方法包括使一种包含多种单克隆抗体的混合物经受至少一种分离方法，从而产生一种基本上不含多聚体的抗体单体制剂，该至少一种分离方法选自下组，该组由以下各项组成：多模式色谱法、磷灰石色谱法以及疏水相互作用色谱法。
【IPC分类】C07K16/00
【公开号】CN105324393
【申请号】CN201480027703
【发明人】A·亨德, T·派斯特, J·王, 王向阳, H·刘
【申请人】米迪缪尼有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年5月12日
【公告号】CA2909969A1, EP2997041A1, US20160083453, WO2014209508A1