一种肝素酶法合成方法
【专利摘要】本发明公开的一种肝素酶法合成方法，包括以下步骤:原料清洗?原料处理?第一次酶解?第二次酶解?提取?吸附?洗脱?沉淀?干燥、酸化，通过合理调整制备方法，有效的提高了肝素钠的合成提取效率，进而肝素产量，减小了肝素钠活性损失，保证合成的肝素的品质和质量，而本发明的合成方法生产条件温和、环境友好、能耗低、效率高，降低肝素合成的成本。
【专利说明】
一种肝素酶法合成方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及肝素的合成，特别是一种肝素酶法合成方法。
【背景技术】
[0002]肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。
[0003]肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。
[0004]肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KD，呈强酸性，由于肝素本身不便于，多是以肝素钠的方式存储，需用时，将肝素钠酸化得到肝素。
【发明内容】
[0005]肝素制备主要是传统的化学裂解法工艺，普遍存在生产条件恶劣、耗能高、效率低的缺点，为改善这一现状，提高一种生产条件温和、环境友好、能耗低、效率高的肝素合成方法，降低肝素合成的成本，本发明公开了一种肝素酶法合成方法。
[0006]为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是:
一种肝素酶法合成方法，其特征在于，包含以下步骤:
一、原料清洗:将猪肠用清水仔细清洗，去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净猪肠；
二、原料处理:通过搅碎机将步骤一中得到的洁净猪肠绞碎成糜状，随后投入搅拌机中，进行搅拌，并同步加入水混合，搅拌时间控制在25?45分钟，最后继续搅拌，并缓慢加入防腐剂，混合均匀，得到酶解原料；
三、第一次酶解:将步骤二中的酶解原料导入酶解罐中，并充分搅拌，同时加入新鲜胰浆作为酶解剂，并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3-8，在继续搅拌的同时，缓慢加热升温至40°042°C，直到搅拌均匀，随后酶解3?5小时，并保温，温度控制在40°C;
四、第二次酶解:第一次酶解完成后，检测并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3-7.5,并加入按料液重量的0.5~1%的蛋白酶，充分搅拌的同时加热料液，温度控制在40°045°C，酶解4?4.2小时；
五、提取:第二次酶解完成后，在40°C下恒温搅拌30分钟，随后急速升温至85°C~95°C，恒温10?15分钟，趁热捞除料液上层的杂质，最后用100目尼龙布精细过滤，得到酶解提取液。
[0007]六、吸附;将步骤五中得到的酶解提取液冷却至室温，并去除酶解提取液表面的油脂后，放入吸附罐，控制升温至40°045°C，保持恒温，随后进行搅拌，并同时缓慢加入树脂，搅拌4?6小时，最后放出废液，收集吸附树脂； 七、洗脱:先将吸附树脂用8倍于吸附树脂体积的清水充分漂洗，干净后，再用I?1.5倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第一次洗脱操作，洗脱4小时；随后用0.5?
0.7倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第二次洗脱操作，洗脱2?2.5小时，最后滤干树脂，将第一次洗脱操作和第二次洗脱操作得到的洗脱液收集、合并；
八、沉淀:将洗脱液过滤后倒入沉淀罐中，充分搅拌，在搅拌的同时逐步缓慢加入乙醇，并通过滴加0.4-0.7mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节PH值至7.2-8.1，然后继续搅拌1~2小时，直至搅拌均匀，随后密封静置24-26小时，待料液沉淀，最后回收上层清液，收集下层沉淀物；
九、干燥、酸化:将上述的下层沉淀物脱水后，烘干，得到肝素钠，将肝素钠以强酸酸化，加入不良溶剂后，取沉淀，烘干得到肝素。
[0008]上述的一种肝素酶法合成方法，其中，所述猪肠为新鲜猪肠或自然解冻后的冷冻猪肠。
[0009]上述的一种肝素酶法合成方法，其中，步骤二中，所述洁净猪肠、水和防腐剂的重量比为1: 1.2?1.5:0.1?0.5(kg:kg: g)，所述防腐剂为脱氢醋酸钠、D-异VC钠抗坏血酸中的一种或2种的混合物。
[0010]上述的一种肝素酶法合成方法，其中，步骤六中，所述树脂为D204树脂、WD-1701树脂或D-254树脂中的一种，所述树脂与酶解提取液的重量比为1:40~50。
[0011]上述的一种肝素酶法合成方法，其中，步骤七中，洗脱操作中使用的氯化钠溶液的浓度为I.2?1.5mol/L0
[0012]上述的一种肝素酶法合成方法，其中，步骤八中，所述乙醇与洗脱液的质量比为2.5-3.7,乙醇的浓度为70%?75%。
[0013]本发明的有益效果为:
本发明公开的一种肝素酶法合成方法，包括以下步骤:原料清洗-原料处理-第一次酶解-第二次酶解-提取-吸附-洗脱-沉淀-干燥、酸化，
通过合理调整制备方法，有效的提高了肝素钠的合成提取效率，进而肝素产量，减小了肝素钠活性损失，保证合成的肝素的品质和质量，而本发明的合成方法生产条件温和、环境友好、能耗低、效率高，降低肝素合成的成本。
【具体实施方式】
[0014]实施例一
一种肝素酶法合成方法，其特征在于，包含以下步骤:
一、原料清洗:将猪肠用清水仔细清洗，去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净猪肠；
二、原料处理:通过搅碎机将步骤一中得到的洁净猪肠绞碎成糜状，随后投入搅拌机中，进行搅拌，并同步加入水混合，搅拌时间控制在35分钟，最后继续搅拌，并缓慢加入防腐剂，混合均匀，得到酶解原料；
三、第一次酶解:将步骤二中的酶解原料导入酶解罐中，并充分搅拌，同时加入新鲜胰浆作为酶解剂，并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.5，在继续搅拌的同时，缓慢加热升温至41°C，直到搅拌均匀，随后酶解4.2小时，并保温，温度控制在40。。； 四、第二次酶解:第一次酶解完成后，检测并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3，并加入按料液重量的0.8%的蛋白酶，充分搅拌的同时加热料液，温度控制在40 °C，酶解4小时；
五、提取:第二次酶解完成后，在40°C下恒温搅拌30分钟，随后急速升温至91°C，恒温12分钟，趁热捞除料液上层的杂质，最后用100目尼龙布精细过滤，得到酶解提取液。
[0015]六、吸附;将步骤五中得到的酶解提取液冷却至室温，并去除酶解提取液表面的油脂后，放入吸附罐，控制升温至43°C，保持恒温，随后进行搅拌，并同时缓慢加入树脂，搅拌4.4小时，最后放出废液，收集吸附树脂；
七、洗脱:先将吸附树脂用8倍于吸附树脂体积的清水充分漂洗，干净后，再用1.5倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第一次洗脱操作，洗脱4小时；随后用0.6倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第二次洗脱操作，洗脱2小时，最后滤干树脂，将第一次洗脱操作和第二次洗脱操作得到的洗脱液收集、合并；
八、沉淀:将洗脱液过滤后倒入沉淀罐中，充分搅拌，在搅拌的同时逐步缓慢加入乙醇，并通过滴加0.5mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节PH值至7.9，然后继续搅拌1.3小时，直至搅拌均匀，随后密封静置24小时，待料液沉淀，最后回收上层清液，收集下层沉淀物；
九、干燥、酸化:将上述的下层沉淀物脱水后，烘干，得到肝素钠，将肝素钠以强酸酸化，加入不良溶剂后，取沉淀，烘干得到肝素。
[0016]其中，所述猪肠为新鲜猪肠，步骤二中，所述洁净猪肠、水和防腐剂的重量比为1:1.3:0.4(kg: kg: g)，所述防腐剂为D-异VC钠抗坏血酸，步骤六中，所述树脂为D204树脂，所述树脂与酶解提取液的重量比为1:44，步骤七中，洗脱操作中使用的氯化钠溶液的浓度为
1.5mol/L，步骤八中，所述乙醇与洗脱液的质量比为3.5，乙醇的浓度为75%。
[0017]实施例二
一种肝素酶法合成方法，其特征在于，包含以下步骤:
一、原料清洗:将猪肠用清水仔细清洗，去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净猪肠；
二、原料处理:通过搅碎机将步骤一中得到的洁净猪肠绞碎成糜状，随后投入搅拌机中，进行搅拌，并同步加入水混合，搅拌时间控制在40分钟，最后继续搅拌，并缓慢加入防腐剂，混合均匀，得到酶解原料；
三、第一次酶解:将步骤二中的酶解原料导入酶解罐中，并充分搅拌，同时加入新鲜胰浆作为酶解剂，并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3-8，在继续搅拌的同时，缓慢加热升温至40°C，直到搅拌均匀，随后酶解4.5小时，并保温，温度控制在 40°C;
四、第二次酶解:第一次酶解完成后，检测并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.5，并加入按料液重量的0.9%的蛋白酶，充分搅拌的同时加热料液，温度控制在40°C，酶解4.2小时；
五、提取:第二次酶解完成后，在40°C下恒温搅拌30分钟，随后急速升温至95°C，恒温15分钟，趁热捞除料液上层的杂质，最后用100目尼龙布精细过滤，得到酶解提取液。
[0018]六、吸附;将步骤五中得到的酶解提取液冷却至室温，并去除酶解提取液表面的油脂后，放入吸附罐，控制升温至45°C，保持恒温，随后进行搅拌，并同时缓慢加入树脂，搅拌6小时，最后放出废液，收集吸附树脂； 七、洗脱:先将吸附树脂用8倍于吸附树脂体积的清水充分漂洗，干净后，再用1.25倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第一次洗脱操作，洗脱4小时;随后用0.66倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第二次洗脱操作，洗脱2.1小时，最后滤干树月旨，将第一次洗脱操作和第二次洗脱操作得到的洗脱液收集、合并；
八、沉淀:将洗脱液过滤后倒入沉淀罐中，充分搅拌，在搅拌的同时逐步缓慢加入乙醇，并通过滴加0.44mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，然后继续搅拌1.4小时，直至搅拌均匀，随后密封静置25小时，待料液沉淀，最后回收上层清液，收集下层沉淀物；
九、干燥、酸化:将上述的下层沉淀物脱水后，烘干，得到肝素钠，将肝素钠以强酸酸化，加入不良溶剂后，取沉淀，烘干得到肝素。
[0019]其中，所述猪肠为新鲜猪肠，步骤二中，所述洁净猪肠、水和防腐剂的重量比为1:1.2:0.35(1^:1^:8)，所述防腐剂为脱氢醋酸钠，步骤六中，所述树脂为￥0-1701树脂，所述树脂与酶解提取液的重量比为1:47，步骤七中，洗脱操作中使用的氯化钠溶液的浓度为1.44mol/L，步骤八中，所述乙醇与洗脱液的质量比为2.98，乙醇的浓度为72%。
[0020]实施例三
一种肝素酶法合成方法，其特征在于，包含以下步骤:
一、原料清洗:将猪肠用清水仔细清洗，去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净猪肠；
二、原料处理:通过搅碎机将步骤一中得到的洁净猪肠绞碎成糜状，随后投入搅拌机中，进行搅拌，并同步加入水混合，搅拌时间控制在37分钟，最后继续搅拌，并缓慢加入防腐剂，混合均匀，得到酶解原料；
三、第一次酶解:将步骤二中的酶解原料导入酶解罐中，并充分搅拌，同时加入新鲜胰浆作为酶解剂，并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.8，在继续搅拌的同时，缓慢加热升温至41°C，直到搅拌均匀，随后酶解4.2小时，并保温，温度控制在40。。；
四、第二次酶解:第一次酶解完成后，检测并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.4，并加入按料液重量的0.77%的蛋白酶，充分搅拌的同时加热料液，温度控制在42°C，酶解4..1小时；
五、提取:第二次酶解完成后，在40°C下恒温搅拌30分钟，随后急速升温至91°C，恒温15分钟，趁热捞除料液上层的杂质，最后用100目尼龙布精细过滤，得到酶解提取液。
[0021]六、吸附;将步骤五中得到的酶解提取液冷却至室温，并去除酶解提取液表面的油脂后，放入吸附罐，控制升温至45°C，保持恒温，随后进行搅拌，并同时缓慢加入树脂，搅拌4小时，最后放出废液，收集吸附树脂；
七、洗脱:先将吸附树脂用8倍于吸附树脂体积的清水充分漂洗，干净后，再用1.33倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第一次洗脱操作，洗脱4小时;随后用0.7倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第二次洗脱操作，洗脱2.1小时，最后滤干树月旨，将第一次洗脱操作和第二次洗脱操作得到的洗脱液收集、合并；
八、沉淀:将洗脱液过滤后倒入沉淀罐中，充分搅拌，在搅拌的同时逐步缓慢加入乙醇，并通过滴加0.5mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，然后继续搅拌1.25小时，直至搅拌均匀，随后密封静置26小时，待料液沉淀，最后回收上层清液，收集下层沉淀物；
九、干燥、酸化:将上述的下层沉淀物脱水后，烘干，得到肝素钠，将肝素钠以强酸酸化，加入不良溶剂后，取沉淀，烘干得到肝素。
[0022]其中，所述猪肠为自然解冻后的冷冻猪肠，步骤二中，所述洁净猪肠、水和防腐剂的重量比为1:1.5:0.5(kg:kg:g)，所述防腐剂为脱氢醋酸钠、D-异VC钠抗坏血酸以1:2的比例混合而成，步骤六中，所述树脂为D-254树脂，所述树脂与酶解提取液的重量比为1:47，步骤七中，洗脱操作中使用的氯化钠溶液的浓度为1.33mol/L，步骤八中，所述乙醇与洗脱液的质量比为2.89，乙醇的浓度为75%，乙醇的浓度为体积百分比浓度。
[0023]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
【主权项】
1.一种肝素酶法合成方法，其特征在于，包含以下步骤: 一、原料清洗:将猪肠用清水仔细清洗，去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净猪肠； 二、原料处理:通过搅碎机将步骤一中得到的洁净猪肠绞碎成糜状，随后投入搅拌机中，进行搅拌，并同步加入水混合，搅拌时间控制在25?45分钟，最后继续搅拌，并缓慢加入防腐剂，混合均匀，得到酶解原料； 三、第一次酶解:将步骤二中的酶解原料导入酶解罐中，并充分搅拌，同时加入新鲜胰浆作为酶解剂，并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3-8，在继续搅拌的同时，缓慢加热升温至40°042°C，直到搅拌均匀，随后酶解3~5小时，并保温，温度控制在40°C; 四、第二次酶解:第一次酶解完成后，检测并通过滴加NaOH溶液，调节酶解罐内料液的PH值，将PH值控制在7.3-7.5,并加入按料液重量的0.5~1%的蛋白酶，充分搅拌的同时加热料液，温度控制在40°045°C，酶解4?4.2小时； 五、提取:第二次酶解完成后，在40°C下恒温搅拌30分钟，随后急速升温至85°C>95°C，恒温10?15分钟，趁热捞除料液上层的杂质，最后用100目尼龙布精细过滤，得到酶解提取液。 六、吸附；将步骤五中得到的酶解提取液冷却至室温，并去除酶解提取液表面的油脂后，放入吸附罐，控制升温至40°C>45°C，保持恒温，随后进行搅拌，并同时缓慢加入树脂，搅拌4?6小时，最后放出废液，收集吸附树脂； 七、洗脱:先将吸附树脂用8倍于吸附树脂体积的清水充分漂洗，干净后，再用I?1.5倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第一次洗脱操作，洗脱4小时；随后用0.5?0.7倍于吸附树脂体积的氯化钠溶液对吸附树脂进行第二次洗脱操作，洗脱2?2.5小时，最后滤干树脂，将第一次洗脱操作和第二次洗脱操作得到的洗脱液收集、合并； 八、沉淀:将洗脱液过滤后倒入沉淀罐中，充分搅拌，在搅拌的同时逐步缓慢加入乙醇，并通过滴加0.4-0.7mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节PH值至7.2-8.1，然后继续搅拌1~2小时，直至搅拌均匀，随后密封静置24-26小时，待料液沉淀，最后回收上层清液，收集下层沉淀物； 九、干燥、酸化:将上述的下层沉淀物脱水后，烘干，得到肝素钠，将肝素钠以强酸酸化，加入不良溶剂后，取沉淀，烘干得到肝素。2.如权利要求1所述的一种肝素酶法合成方法，其特征在于，所述猪肠为新鲜猪肠或自然解冻后的冷冻猪肠。3.如权利要求1所述的一种肝素酶法合成方法，其特征在于，步骤二中，所述洁净猪肠、水和防腐剂的重量比为1:1.2?1.5:0.1?0.5(kg:kg:g)，所述防腐剂为脱氢醋酸钠、D-异VC钠抗坏血酸中的一种或2种的混合物。4.如权利要求1所述的一种肝素酶法合成方法，其特征在于，步骤六中，所述树脂为D204树脂、WD-1701树脂或D-254树脂中的一种，所述树脂与酶解提取液的重量比为1:40?50 ο5.如权利要求1所述的一种肝素酶法合成方法，其特征在于，步骤七中，洗脱操作中使用的氯化钠溶液的浓度为I.2?1.5mol/L。6.如权利要求1所述的一种肝素酶法合成方法，其特征在于，步骤八中，所述乙醇与洗 脱液的质量比为2.5-3.7,乙醇的浓度为70%?75%。
【文档编号】C08B37/10GK106008751SQ201610466559
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】周贤轩, 黄辉其, 黄艳
【申请人】江苏玺鑫维生素有限公司