LC)以及尺寸排阻色谱法（SEC)。
[0029] 如在此所使用，"重组多克隆抗体（rpAb) "意指以掺合物形式的多种单克隆抗体。 在本发明的这些方法中，各个组分mAb在相同生物反应器中共表达并且一起纯化，或在分 开的生物反应器中表达并且在纯化过程期间的任何时间点下混合在一起。
[0030] 如在此所使用，当"逐步改变"涉及洗脱条件时，其意指电导率瞬间的或非常快速 的改变，典型地发生在小于1个柱体积中，以便从树脂上洗脱rpAb混合物。
[0031] 如在此所使用，当"线性梯度"涉及洗脱条件时，其意指经过固定的持续时间发生 的电导率的渐变，典型地在1个柱体积与50个柱体积之间。
[0032] 如在此所使用，"缓冲物质"是指可以抵抗pH变化的弱酸和它的共辄碱，或弱碱和 它的共辄酸。缓冲物质可以是选自列表，该列表包括但不限于乙酸、磷酸、柠檬酸、三羟甲基 氨基甲烷以及二（三羟甲基氨基甲烷）。
[0033] 如在此所使用，"盐"是阴离子和阳离子的组合。阳离子可以是选自列表，该列表包 括但不限于钠、铵、钙、镁以及钾。阴离子可以是选自列表，该列表包括但不限于氯化物、磷 酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐以及硫酸盐。
[0034] 如在此所使用的术语"和/或"应当被看作在有或没有另一者的情况下，两个指定 的特征或组分中的每一者的特定披露。例如，"A和/或B"应当被看作（i)A、（ii)B以及 (i i i) A和B中的每一种的特定披露，就好像各自被在此单独陈述一样。 (A) rpAb的分离
[0035] 包含多种单克隆抗体（每种具有它们所附带的化学特性）的重组多克隆抗体 (rpAb)为纯化提出了重大挑战。出乎意料地，已经发现单独地或组合地一些分离技术（确 切地，疏水相互作用色谱法、多模式色谱法以及磷灰石色谱法）可以从含有这些抗体的多 聚体物质的混合物中分离单体，同时以高纯度的单体将各个单克隆抗体的比率维持在窄范 围中。
[0036] 通常，rpAb的混合物将首先经受一个或多个色谱分离技术，以便在去除多聚体之 前去除与方法相关的杂质。本领域中常用色谱技术的选择可以包括从澄清的细胞培养基中 捕获rpAb混合物的蛋白A亲和色谱法和去除另外的与方法相关的物质的阴离子交换。这 些初始纯化步骤不改变各个mAb组分的比率，并且它们不会明显降低rpAb混合物中的多聚 体水平。 (B) 分离技术 1.多模式色谱法
[0037] 可以使用商业上可获得的树脂（如由通用医疗生命科学部门（GE ealthcare Life Sciences)销售的名称为"Capto Adhere"）并且通过本领域中已知的任何多模式缓冲系统 来进行多模式色谱法。在本发明的该方法中，多模式色谱法使用了结合离子交换和疏水相 互作用基团的树脂。所使用的树脂可以被装填到制备成流化床柱或作为分批制备的柱中。 可以在结合和洗脱条件下操作多模式色谱法，其中单体和多聚体两者均结合到柱上，并且 然后使用盐浓度和/或pH的变化选择性洗脱单体；或在流过条件下操作多模式色谱法，其 中多聚体结合到柱上而各个单体大部分保留在柱流过液（flowthrough)中。本领域技术人 员将能够选择用于这两个选项的条件。
[0038] 作为在流过条件下操作的非限制性实例，平衡缓冲液可以主要由25mM乙酸盐、 100mM氯化钠组成，pH为5. 0。在一些实施例中，该缓冲液包含5mM至200mM乙酸盐。在一 些实施例中，该缓冲液包含10mM至lOOmM乙酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含15mM至 35mM乙酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含25mM乙酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包 含0M至1M盐。在一些实施例中，该缓冲液包含0M至1M氯化钠。在一些实施例中，该缓冲 液包含50mM至500mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含80mM至120mM氯化钠。在 一些实施例中，该缓冲液包含90mM至110mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含lOOmM 氯化钠。在一些实施例中，该pH是在约3.0至6.0的范围内。在一些实施例中，该pH是在 约4. 5至5. 5的范围内。在一些实施例中，该pH是5.0。
[0039] 在另一个在流过条件下操作的非限制性实例中，可以使用的该平衡缓冲液主要由 50mM三羟甲基氨基甲烷、lOOmM氯化钠组成，pH = 7. 25。在一些实施例中，该缓冲液包含5mM 至200mM三羟甲基氨基甲烷。在一些实施例中，该缓冲液包含10mM至lOOmM三羟甲基氨基 甲烷。在一些实施例中，该缓冲液包含40mM至60mM三羟甲基氨基甲烷。在一些实施例中， 该缓冲液包50mM三羟甲基氨基甲烷。在一些实施例中，该缓冲液包含0M至1M盐。在一些 实施例中，该缓冲液包含0M至1M氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含50mM至500mM 氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含80mM至120mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲 液包含90mM至110mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含100mM氯化钠。在一些实施 例中，该pH是在约6.0至10. 0的范围内。在一些实施例中，该pH是在约7.0至9.0的范 围内。在一些实施例中，该pH是7.1至7. 5。在一些实施例中，该pH是7. 25。
[0040] 上样缓冲液基本上与该平衡缓冲液（具有rpAb)相同
[0041] 可以用基本上与该上样缓冲液（不具有rpAb)相同的缓冲液洗涤树脂。
[0042] 可以基于在产物峰前部和尾部的25mAU处的吸光度来收集柱流过液中的蛋白质。 2.磷灰石色谱法
[0043] 可以使用不同的用于上样、洗涤以及洗脱的缓冲液来进行磷灰石色谱法。所使用 的树脂可以被装填到制备成流化床柱或作为分批制备的柱中。可以在结合和洗脱条件下操 作磷灰石色谱法，其中单体和多聚体两者均结合到柱上，并且然后使用盐浓度和/或pH的 变化选择性洗脱单体；或在流过条件下操作磷灰石色谱法，其中多聚体结合到柱上而各个 单体大部分保留在柱流过液中。本领域技术人员将能够选择用于这两个选项的条件。
[0044] 作为在结合和洗脱条件下的非限制性实例，可以使用的该平衡缓冲液主要由10mM 磷酸盐、lOOmMNaCl组成，pH为7. 0。在一些实施例中，该缓冲液包含约ImM至100mM磷酸 钠。在一些实施例中，该缓冲液包含2mM至50mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含约 5mM至15mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含10mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓 冲液包含约OmM至lOOmM盐。在一些实施例中，该缓冲液包含约OmM至100mM氯化钠。在 一些实施例中，该缓冲液包含ImM至50mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含5mM至 15mM氯化钠。在一些实施例中，该缓冲液包含10mM氯化钠。在一些实施例中，该pH是在约 6. 2至8.0的范围内。在一些实施例中，该pH是在约6. 8至7. 2的范围内。在一些实施例 中，该pH是7.0。
[0045] 该上样缓冲液基本上与该平衡缓冲液（具有rpAb)相同
[0046] 可以用基本上与该上样缓冲液（不具有rpAb)相同的缓冲液洗涤树脂。
[0047] 为了洗脱，该缓冲液可以是包含约0. 05M至3M NaCl，具有在约6. 2至8. 0范围内 的pH的较高离子强度（高于该平衡和上样缓冲液）磷酸盐缓冲液。在一些实施例中，该缓 冲液包含约ImM至100mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含2mM至50mM磷酸盐。在 一些实施例中，该缓冲液包含约5mM至15mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含10mM 磷酸盐。在一些实施例中，使用盐的逐步或线性梯度来洗脱，其中该逐步或梯度是从约〇M 至3M盐。在一些实施例中，使用氯化钠的逐步或线性梯度来洗脱，其中该逐步或梯度是从 约0M至3M氯化钠。在一些实施例中，使用氯化钠的逐步或线性梯度来洗脱，其中该逐步或 梯度是从约ImM至1M氯化钠。在一些实施例中，该pH是在约6. 5至7. 5的范围内。在一 些实施例中，该pH是在约6. 8至7. 2的范围内。在一些实施例中，该pH是7. 0。 3.疏水相互作用色谱法
[0048] 可以使用不同的用于上样、洗涤以及洗脱的缓冲液进行疏水相互作用色谱法。所 使用的树脂可以被装填到制备成流化床柱或作为分批制备的柱中。可以在结合和洗脱条件 下操作疏水相互作用色谱法，其中单体和多聚体两者均结合到柱上，并且然后使用盐浓度 和/或pH的变化选择性洗脱单体；或在流过条件下操作疏水相互作用色谱法，其中多聚体 结合到柱上而各个单体大部分保留在柱流过液中。本领域技术人员将能够选择用于这两个 选项的条件。
[0049] 作为在结合和洗脱条件下的非限制性实例，可以使用的该衡缓冲液主要由包含 0. 6M硫酸钠并且pH为7. 0的磷酸盐缓冲液组成。在一些实施例中，该缓冲液包含约5mM至 200mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含约10mM至lOOmM磷酸盐。在一些实施例中， 该缓冲液包含约15mM至25mM磷酸盐。在一些实施例中，该缓冲液包含20mM磷酸盐。在一 些实施例中，该缓冲液包含约〇. 2M至2M盐。在一些实施例中，该缓冲液包含约0. 3M至1M 盐。在一些实施例中，该缓冲液包含约0. 5M至0. 7M盐。在一些实施例中，该缓冲液包含 0. 5M至0. 7M硫酸钠。在一些实施例中，该缓冲液包含0. 6M硫酸钠。在一些实施例中，该 pH是在约6. 2至8.0的范围内。在一些实施例中，该pH是在约6. 8至7. 2的范围内。在一 些实施例中，该pH是7.0。
[0050] 该上样缓冲液基本上与该平衡缓冲液（具有rpAb)相同
[0051] 可以用基本上与该上样缓冲液（不具有rpAb)相同的缓冲液洗涤树脂。
[0052] 为了洗脱，该缓冲液可以是包含约OmM至0. 6mM硫酸钠并且pH为约7. 0的较低 离子强度磷酸盐缓冲液（即低于该平衡和上样缓冲液）。在一些实施例中，该缓冲液包含 0.1 mM至0. 5mM盐。在一些实施例中，使用逐步或线性梯度的不断减少的盐来洗脱，其中该 逐步或梯度是从约1M至0M盐。在一些实施例中，使用逐步或线性梯度的不断减少的硫酸钠 来洗脱，其中该逐步或梯度是从约〇. 8M至0M盐。在一些实施例中，使用逐步或线性梯度的 不断减少的硫酸钠