一种快速有效的提取发育早期棉籽中油脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及植物油脂化学领域以及植物种子油脂的提取；更具体地，本发明具体涉及一种在棉花花后5-10天的棉籽中有效快速提取其总油脂，并用于脂肪酸组分的鉴定与含量的分析。
【背景技术】
[0002]棉花既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物。棉籽脱壳后的棉仁中油脂含量达25%?39%，是世界上次于大豆、棕榈、油菜、油葵的第五大植物油来源。2012年我国棉籽产量约为1186万吨，棉籽油的产量为144.7万吨，棉籽油消费量达144.4万吨，是我国第四大食用植物油。
[0003]发育成熟的棉籽中，其油脂的脂肪酸组分主要是由饱和脂肪酸的棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)，和单不饱和脂肪酸的油酸(C18:l)、以及多不饱和脂肪酸的亚油酸(C18:2)、α-亚麻酸(C18:3)等组成。它们的相对含量分别约为:25%、2%、15%、57%、0.
[0004]植物体中各种脂肪酸积累模式的形式与植物体自我防御以及对后代的保护机制密切相关。迄今为止，关于棉籽发育过程中，脂肪酸累积动态变化及各脂肪酸之间相关性的研宄报道甚少。
[0005]油料作物种子发育的不同时期，其脂肪酸组成会发生很大变化。由于发育早期(花后5-10天)的棉籽较小，油脂提取较为困难，影响了对棉花胚胎发育早期脂肪酸组分的鉴定与分析。
[0006]本发明建立了一种快速有效的提取发育早期(花后5-10天)棉籽中油脂的方法，所提取的油脂可用于色谱进行脂肪酸组分的鉴定与含量的分析，从而便于分析棉籽发育早期，主要脂肪酸的积累、油脂含量等的动态变化，有助于对棉籽脂肪酸代谢网络和时空调控有更深入的了解。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对发育早期棉籽的油脂较难提取，从而不利于脂肪酸组分的分析，提供一个快速有效提取发育早期棉籽油脂总量。
[0008]本发明的第一方面是提供一种有效、简便、快速的提取发育早期棉籽中油脂的方法。
[0009]本发明的另一方面是提供基于GC-MS测定棉籽油脂中脂肪酸组分相对含量，通过在提取油脂的溶剂中增添内标正二十四碳烷的方法，对各脂肪酸组分的进行定量分析。
[0010]本发明的技术方案在于样品的选择和初期的处理上，由于发育早期(花后5-10天)棉籽较小，本发明采用在棉花开花时进行挂牌标记，并标明开花日期，选择开花期发育一致的植株，分别收集较多的花后5、10天的棉花种子发育早期阶段的棉籽样品，并用镊子将棉籽从棉桃中取出，轻轻剥离棉籽外壳等，取出棉仁收集于50ml离心管中，液氮速冻后，至-80°C超低温冰箱中保存，并且每个样品重复三次试验。
[0011]本发明的技术方案还在于使用液氮碾磨棉仁样品，采用进口密闭离心管，避免高温及长时间的常规旋转蒸发等方法造成油脂中多不饱和脂肪酸组分的氧化。
[0012]本发明的技术方案还在于通过在提取油脂的溶剂中增添内标正二十四碳烷的方法，对各脂肪酸组分的进行定量分析。
【附图说明】
[0013]图1为花后5天棉籽脂肪酸甲酯的气相色谱图。
[0014]图2为花后10天棉籽脂肪酸甲酯的气相色谱图。
具体的实施方式
[0015]实施例1，发育早期的棉籽取样
[0016]在棉花开花时进行挂牌标记，并标明开花日期，选择开花期发育一致的植株，标记主花序和第一分枝花序上同一天开的花，分别取花后5、10天的棉花种子发育早期阶段的棉籽样品，每个样品重复三次试验。
[0017]实施例2，发育早期棉籽的油脂提取
[0018]用镊子将棉籽从棉桃中取出，轻轻剥离棉籽外壳等，取出棉仁收集于50ml离心管中，液氮速冻后，至_80°C超低温冰箱中保存。
[0019]取出冷冻保存的棉仁样品，用液氮将其研磨成粉，取10 yg装入1.5ml离心管中，加入0.6ml氯仿-甲醇(体积比2: I)混合溶剂，在40°C、200r/min摇床上处理4h后，6000r/min 离心 1min0
[0020]称量恒重的1.5ml离心管的重量，然后吸取下层油脂相层于离心管中，在25°C旋转真空干燥仪上蒸干至恒重，称重，减去离心管中，计算油脂得率达30%。
[0021]在上述离心管中，加入0.2mllmol/L KOH-甲醇溶液，60°C水浴皂化30min后，再加入0.4mL lmol/1盐酸-甲醇溶液，60°C水浴甲醋化30min，取出至室温。
[0022]加入0.2ml正己烷(含内标正二十四碳烷0.1yg)，充分振摇，静置，吸取上层正己烷甲酯相至Iml小离心管，用少量无水Na2SOJ^水后，用气相色谱(GC-MS)测定样品中主要脂肪酸组分的相对含量。
[0023]实施例3，棉籽脂肪酸组分的GC-MS分析
[0024]利用Agilent Technologies 7890A GC System 进行 GC-MS 分析，色谱柱 HP-5MS19091S-436(60mX250 ymX0.25 μ m);进样量I μ L，分流进样方式，分流比50: I;进样口温度250°C ;载气Ne，20mL/min。程序升温，150°C下保持lmin，然后以10°C /min的速率升至180°C，保持5min，以3°C /min的速率升至230°C，保持15min，再以3°C /min的速率升至270°C，保持 20min。
[0025]气相色谱测定表明，与发育成熟棉籽的C16:0，C18:0，C18:1，C18:2，C18:3(相对含量分别为:25%、2%、15%、57%、0.2% )相比，棉籽中C16:0，C18:0，C18:3脂肪酸组分的积累主要集中在种子发育早中期；在花后5天的棉籽样品中，C16:0，C18:0, C18:1，C18:2，C18:3 的相对含量分别为:34.94%,21.86%,7.45%、14.51%、15.87% ;在花后 10 天的棉籽样品中的相对含量分别为:33.11%、15.37%,8.03%,24.66%、13.48%。
【主权项】
1.样品的初期处理:采用在棉花开花时进行挂牌标记，并标明开花日期，选择开花期发育一致的植株，分别收集棉花种子发育早期阶段(花后5、10天)的棉籽样品，并用镊子将棉籽从棉桃中取出，轻轻剥离棉籽外壳等，取出棉仁收集于50ml离心管中，液氮速冻后，至-80°C超低温冰箱中保存。
2.有效快速的提取方法:使用液氮碾磨棉仁样品，称取一定量粉末(10μ g)，装入进口可密闭1.5ml离心管，经氯仿-甲醇(体积比2: I)等处理后，然后吸取油脂相层于离心管中，在低温旋转真空干燥仪上蒸干至恒重，减去离心管中重，计算油脂获得率，并避免高温及长时间的常规旋转蒸发等方法造成油脂中多不饱和脂肪酸组分的氧化。
3.通过在提取油脂的溶剂中增添内标正二十四碳烷的方法(0.2ml正己烷中含内标正二十四碳烷0.1 μ g)，对各脂肪酸组分的进行定量分析。
【专利摘要】针对发育早期棉籽的油脂较难提取，从而不利于其脂肪酸组分的分析，本发明建立了一种有效、简便、快速的提取发育早期棉籽(花后5-10天)中油脂的方法，该方法避免了高温及常规旋转蒸发等提取方法造成油脂中多不饱和脂肪酸组分的氧化；所提取的油脂可直接用于GC-MS进行脂肪酸组分的鉴定与相对含量的分析，并通过在提取油脂的溶剂中增添内标的方法，对发育早期棉籽油脂的各脂肪酸组分的进行定量分析。本发明能有效快速提取棉籽中总油脂，便于分析在棉花种子发育早期，棉籽中油脂含量及其主要脂肪酸的积累等的动态变化。
【IPC分类】G01N30-06
【公开号】CN104764834
【申请号】CN201510150527
【发明人】刘峰, 赵伊英, 孙杰
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月24日